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(1)通过筛选出普通小鼠和糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面（以下简称2种创面）中CD34 ⁺细胞后进行单细胞RNA测序，鉴定了7种CD34 ⁺细胞类型和5个成纤维细胞亚群，证明CD34 ⁺细胞在2种创面愈合过程中均具有高异质性。

(2)报道在2种创面中存在CD34 ⁺平滑肌细胞和类软骨细胞，表明CD34 ⁺细胞具有多谱系分化特征。

(3)通过生物信息学分析明确在2种创面中CD34 ⁺细胞亚群存在与创面愈合过程紧密相关的功能差异，为难愈性创面的细胞治疗提供了理论依据。

Highlights:

(1)CD34 ⁺ cells were isolated from full-thickness skin defect wounds of normal mice and diabetic mice (hereinafter referred to as two types of wounds) and analyzed by using single-cell RNA sequencing, with seven CD34 ⁺ cell types and five fibroblast subpopulations being identified, indicating CD34 ⁺ cells were highly heterogeneous in the healing process of two types of wounds.

(2)It was reported that CD34 ⁺ smooth muscle cells and chondrocyte-like cells existed in two types of wounds, indicating multi-lineage differentiation characteristics of CD34 ⁺ cells.

(3)Bioinformatics analysis revealed functional differences in CD34 ⁺ cell subpopulations that were closely related to wound healing process in two types of wounds, providing the theoretical basis for cellular therapy in refractory wounds.

创面修复涉及多种细胞类型在时间和空间上的协同作用，当创面微环境受到高血糖、感染等影响时，细胞功能受损，导致创面修复异常 ^{［ 1］} 。通过单细胞RNA测序能够获得单个细胞RNA转录信息，准确描述细胞分类及状态，有助于研究细胞类型之间的关系和相关信号机制 ^{［ 2］} 。在糖尿病患者中，高血糖状态使创面愈合进一步复杂化，形成糖尿病创面，但其形成机制尚不清楚 ^{［ 3］} 。因此，利用单细胞RNA测序深入理解糖尿病创面中细胞异质性及功能特性对研究和促进糖尿病创面愈合至关重要。CD34是一种细胞表面跨膜蛋白，被认为是造血干细胞等的标志物 ^{［ 4］} 。在正常皮肤中，CD34主要分布在内皮细胞、真皮树突状细胞和毛囊周细胞中，并被认为是毛囊干细胞的标志物 ^{［ 5］} 。CD34 ⁺细胞在创面周围的表达具有时序性，并具备多向分化潜能和自我更新能力 ^{［ 6, 7］} 。此外，CD34 ⁺细胞在创面愈合过程中具有重要功能，包括支持毛囊再生、促进上皮再生、机械支持、细胞间通讯和免疫调节等 ^{［ 5， 8］} 。但CD34 ⁺细胞的功能异质性尚未被完全理解，限制了其在创面治疗中的应用。本研究拟揭示CD34 ⁺细胞在小鼠皮肤创面愈合过程中的异质性，并针对糖尿病创面中的细胞功能变化展开分析，旨在促进更有效的难愈性创面细胞治疗方案的构建。

1.   材料与方法

本实验研究经广东省医学实验动物中心（下称本单位）实验动物伦理委员会批准，批号：C202209-1，遵循国家和本单位有关实验动物管理和使用的规定。

1.1   动物及主要试剂和仪器来源

3只7~8周龄体重20~25 g雄性无特殊病原体级健康 Cd34-环化重组酶（cyclization recombinase，Cre）-孕激素受体1（ Cd34-cyclization recombinase-progesterone receptor 1， Cd34-CrePR1）小鼠和6只7~8周龄体重20~25 g雌性无特殊病原体级健康膜-番茄红/膜-绿色（membrane-tomato/membrane-green，mT/mG）小鼠由中山大学药学院（深圳）王旭升课题组赠予 ^{［ 9］} 。米司非酮、链脲佐菌素、中性蛋白酶Ⅱ、DNA酶Ⅰ购自美国Sigma公司，胶原蛋白酶Ⅰ、胶原蛋白酶Ⅳ、Hanks平衡盐溶液购自美国赛默飞世尔科技公司，山羊血清、兔源性角蛋白14单克隆抗体、Alexa Fluor 647标记的山羊抗兔IgG抗体购自美国Abcam公司，玉米油、牛血清白蛋白购自北京索莱宝科技有限公司，含4'，6-二脒基-2-苯基吲哚的封片剂购自美国SouthernBiotech公司。蔡司880型激光扫描共聚焦显微镜购自德国蔡司公司，BD FACSAria Ⅲ型激光流式分选仪购自美国BD公司。

1.2 CD34 ⁺细胞谱系追踪小鼠的建立和Cre表达的诱导

取3只 Cd34-CrePR1小鼠与6只mT/mG小鼠杂交获得后代。取杂交后代，参照文献［ 9］鉴定小鼠基因型，结果显示小鼠同时表达CrePR1和mT/mG，被认定为CD34 ⁺细胞谱系追踪小鼠。将米司非酮溶解于玉米油中配成10 mg/mL溶液后以100 mg/kg的剂量腹腔注射至12只雄性CD34 ⁺细胞谱系追踪小鼠体内，连续注射5 d以诱导Cre表达，实现CD34 ⁺细胞在荧光条件下可视化 ^{［ 10］} 。

1.3   小鼠创面模型的建立

1.3.1   糖尿病小鼠模型的建立

参照文献［ 11］方法，配制质量浓度为7.5 mg/mL的链脲佐菌素溶液。取6只7~8周龄雄性CD34 ⁺细胞谱系追踪小鼠（设为糖尿病组），禁食4 h后，以50 mg/kg剂量腹腔注射7.5 mg/mL链脲佐菌素溶液，连续注射5 d。末次注射4周后进行随机血糖检测，小鼠血糖均≥11.1 mmol/L，即成功建立CD34 ⁺细胞谱系追踪糖尿病小鼠模型。

1.3.2   创面模型的建立

取6只13周龄雄性CD34 ⁺细胞谱系追踪小鼠（设为对照组）和1.3.1中6只生长至13周龄雄性CD34 ⁺细胞谱系追踪糖尿病小鼠，使用100 g/L戊巴比妥钠以50 mg/kg剂量进行腹腔注射麻醉（麻醉方法下同）。将小鼠背部皮肤常规脱毛消毒后，于背部正中用皮肤打孔器制备直径4 mm的全层皮肤缺损创面，使用硅胶圈和3M膜固定创面防止收缩。

1.4   创面形态的观察

伤后0（即刻）、4 d，采用光学照相机对2组小鼠创面进行拍照，观察创面形态。糖尿病组1只小鼠于伤后2 d因术后状态不佳死亡。

1.5 CD34 ⁺细胞在创面中的定位

伤后4 d，取2组各3只小鼠麻醉后，取创面新生及创周30 mm范围内的皮肤组织，放入40 g/L多聚甲醛固定液中固定24 h后，用300 g/L蔗糖溶液脱水24 h，常规包埋后，以10 µm厚度进行冰冻切片。使用含50 g/L山羊血清和体积分数0.02% Triton X-100的PBS室温封闭处理组织2 h。一抗为兔源性角蛋白14单克隆抗体（稀释比为1∶200），二抗为Alexa Fluor 647标记的山羊抗兔IgG抗体（稀释比为1∶500），使用含4'，6-二脒基-2-苯基吲哚的封片剂封片。于20倍激光扫描共聚焦显微镜下观察CD34 ⁺细胞（阳性染色为绿色）的定位及与标记表皮基底细胞的角蛋白14（阳性染色为白色）的共定位表达情况。

1.6 创面中CD34 ⁺细胞的单细胞RNA测序及分析

1.6.1   单细胞悬液的制备

伤后4 d，同1.5的方法取对照组3只小鼠和糖尿病组2只小鼠创面组织，放入预冷的Hanks平衡盐溶液中，去掉脂肪组织后切成直径<1 mm的碎片。加入2.5 mg/mL中性蛋白酶Ⅱ、2 mg/mL胶原蛋白酶Ⅰ、2 mg/mL胶原蛋白酶Ⅳ、50 U/mL DNA酶Ⅰ和10 g/L的牛血清白蛋白，在37 ℃细胞培养箱中消化3 h将组织消化成单细胞。将细胞悬液用70 μm和40 μm过滤网过滤，并重新悬浮于含有0.5 g/L牛血清白蛋白的PBS中。

1.6.2 CD34 ⁺细胞的筛选

采用荧光活化细胞分选法进行筛选。取1.6.1中获得的2组小鼠创面单细胞悬液，分别用激光流式分选仪筛选CD34 ⁺细胞，使用488 nm激光激发。根据直方图以及前向散射和侧散射筛选出状态好的带绿色荧光的单细胞，即CD34 ⁺细胞。将CD34 ⁺细胞收集在Hanks平衡盐溶液中。

1.6.3   单细胞RNA测序

将1.6.2分选出的CD34 ⁺细胞交由广州艾基生物技术有限公司进行文库构建、单细胞RNA测序，操作如下。将CD34 ⁺单细胞悬液通过有限稀释法分布在微孔中，将带有寡核苷酸条形码的微珠与细胞配对，进行mRNA分子杂交，用唯一分子标识符和指示细胞来源的细胞条形码标记每个mRNA分子，将标记的mRNA经反转录和扩增，构建互补DNA文库，最终使用Illumina NovaSeq平台进行单细胞RNA测序。

1.6.4   单细胞RNA测序数据分析

使用R语言的Seurat 4.0.2程序对单细胞RNA测序数据进行处理。

1.6.4   .1 单细胞RNA统计分析

在质量控制、表达矩阵归一化、高变异基因识别、主成分分析后，使用RunUMAP功能对CD34 ⁺细胞进行非线性降维和可视化，建立一致的流形近似和投影云图，利用FindClusters功能进行无监督细胞聚类分析，将CD34 ⁺细胞分为细胞亚群，使用细胞类别分布功能对细胞亚群占比进行统计。汇总2组小鼠创面组织中CD34 ⁺细胞数据，应用FindAllMarkers功能总体分析各细胞亚群的标记基因和用于注释各细胞亚群的标记基因，使用热图展示各细胞亚群前10高表达标记基因，绘制点图展示注释各细胞亚群的标记基因。

1.6.4   .2 差异表达基因（differentially expressed gene，DEG)的鉴定及功能富集分析

通过FindMarkers功能分析Fb亚群1、Fb亚群2、平滑肌细胞、KC、类软骨细胞在2组小鼠创面组织间的基因表达差异。根据以下标准鉴定差异表达显著的DEG：｜log ₂（差异倍数）｜≥0.1，同时 P≤0.05。使用注释可视化和集成发现数据库（ https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）的功能注释工具对差异表达显著的DEG进行基因本体论（gene ontology，GO）、京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，由数据库提供的Fisher确切概率法确定显著性，以 P<0.05表示显著富集（结果较多者，仅展示前10数据）。

2.   结果

2.1 创面形态及CD34 ⁺细胞在创面中的定位

伤后4 d，糖尿病组小鼠创面相对于对照组创面愈合延迟，且新生表皮较薄。伤后4 d，在对照组小鼠创面周围组织中，CD34主要表达在真皮、毛囊膨突区、血管周围和部分表皮细胞中；在新生表皮中，部分细胞表达CD34。相较于对照组，CD34 ⁺细胞在糖尿病组小鼠创面周围组织中毛囊部位的数量减少，在创面愈合前缘中也有CD34 ⁺细胞的表达。见 图1。

注：对照组小鼠为CD34⁺细胞谱系追踪小鼠，糖尿病组小鼠为CD34⁺细胞谱系追踪糖尿病小鼠；CD34⁺细胞呈绿色，非CD34⁺细胞呈红色，角蛋白14呈白色，细胞核呈蓝色

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2.2 CD34 ⁺细胞亚群和占比

伤后4 d，从对照组和糖尿病组小鼠创面中分别获得4 931、2 750个CD34 ⁺细胞，均包含11个细胞亚群、7种细胞类型。细胞类型包括内皮细胞、Fb、KC、巨噬细胞、T细胞、平滑肌细胞和类软骨细胞，其中Fb可以分为5个亚群。相比于对照组，糖尿病组小鼠创面组织中的CD34 ⁺内皮细胞、Fb亚群1、Fb亚群4、KC、类软骨细胞占比升高，CD34 ⁺Fb亚群2、Fb亚群3和平滑肌细胞占比下降。见 图2。

注：对照组小鼠为CD34⁺细胞谱系追踪小鼠，糖尿病组小鼠为CD34⁺细胞谱系追踪糖尿病小鼠

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2.3 CD34 ⁺细胞亚群高表达标记基因与注释基因

各CD34 ⁺细胞亚群前10高表达标记基因见 图3A。用于注释细胞亚群的标记基因见 图3B，包括注释类软骨细胞的转移相关肺腺癌转录本1、注释内皮细胞的脂肪酸结合蛋白4、注释Fb亚群1的Gremlin 1、注释Fb亚群2的补体成分4B、注释Fb亚群3的H19印记母源表达转录本、注释Fb亚群4的Dickkopf Wnt信号通路抑制剂2、注释Fb亚群5的纤维调节蛋白、注释KC的角蛋白5、注释巨噬细胞的CD74分子、注释平滑肌细胞的G蛋白信号调节蛋白5（regulator of G protein signaling 5， RGS5）、注释T细胞的可诱导T细胞共刺激分子。

注：对照组小鼠为CD34⁺细胞谱系追踪小鼠，糖尿病组小鼠为CD34⁺细胞谱系追踪糖尿病小鼠；图3A从左至右各列依次分别为标记类软骨细胞的线粒体编码的细胞色素C氧化酶Ⅱ（MT-CO2）、MT-CO1、MT-CO3、线粒体细胞色素b、线粒体编码的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸：泛醌氧化还原酶核心亚基1（MT-ND1）、线粒体编码的ATP合酶膜亚基6、MT-ND4、MT-ND2、MT-ND3、转移相关肺腺癌转录本1（MALAT1），标记内皮细胞的脂肪酸结合蛋白4（FABP4）、选择素P、血小板和内皮细胞黏附分子1、水通道蛋白1、CD36分子、跨膜4 L六家族成员1、质膜小囊泡相关蛋白、清道夫受体B类成员1、含载脂蛋白L结构域1、富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1，标记成纤维细胞（Fb）亚群1的Gremlin 1（GREM1）、胰岛素样生长因子结合蛋白1、基质金属蛋白酶3（MMP3）、细胞视黄酸结合蛋白1、Fcγ受体Ⅱb、MMP11、凝血因子ⅩⅢ A链、ⅩⅩⅢ型胶原蛋白α1（COL23A1）、羧肽酶X-M14家族成员1、血清淀粉样蛋白A3，标记Fb亚群2的补体成分4B（C4B）、羧肽酶Z、COL1A2、COL1A1、AE结合蛋白1、转化生长因子β诱导蛋白、类纤维蛋白原样蛋白2、前胶原C-内肽酶增强子2、整合素亚基β样1、导向蛋白3B抗体，标记Fb亚群3的H19印记母源表达转录本（H19）、C-X-C趋化因子配体1（CXCL1）、CXCL5、正五聚蛋白3、分泌型卷曲相关蛋白2、微纤维相关蛋白5、白细胞介素（IL）1受体类似物2、蛋白聚糖4、血小板反应蛋白4和COL4A1，标记Fb亚群4的Dickkopf Wnt信号通路抑制剂2（DKK2）、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶2、凝血因子Ⅱ凝血酶受体、肽酶抑制剂16、细胞色素P450家族1亚家族B成员1、生长停滞特异性1、群体凝血因子C同源物、核受体亚家族4A组成员1、弹性蛋白、结缔组织生长因子，标记Fb亚群5的纤维调节蛋白（FMOD）、Wnt抑制因子1、腱调蛋白、胆囊收缩素、胶质蛋白、Ig超家族成员10（IGSF10）和IGSF5，标记角质形成细胞的角蛋白5、分层蛋白、角蛋白17、角蛋白15、角蛋白14、半乳糖凝集素7、与外周髓磷脂蛋白22相关的P53凋亡效应物质、胎盘表达转录本1、角蛋白6a和角质蛋白连接蛋白，标记巨噬细胞的CD74分子、组织相容性Ⅱ类抗原Aα、H2-Ab1、溶菌酶2、C-C型趋化因子配体3（CCL3）、S100钙结合蛋白A9、CCL4、CD14分子、丝氨酸和CXCL3，标记平滑肌细胞的G蛋白信号调节蛋白5（RGS5）、Notch受体3、肌球蛋白重链11、11号染色体开放阅读框96、内皮素受体B型、肌球蛋白轻链9、平滑肌肌动蛋白α-2、肌球蛋白轻链激酶、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白类似蛋白1、转胶蛋白，标记T细胞的可诱导T细胞共刺激分子（ICOS）、IL-17A、IL-17F、RGS1、IL-2受体亚单位β、溶酶体蛋白跨膜5、胚细胞抗原、环腺苷酸反应元件调制器、液泡蛋白分拣相关蛋白37B、RGS2；图3B横坐标下1为MALAT1，2为FABP4，3为GREM1，4为C4B，5为H19，6为DKK2，7为FMOD，8为角蛋白5，9为CD74分子，10为RGS5，11为ICOS；标记Fb亚群5的3个基因与其他细胞标记基因重叠

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2.4 CD34 ⁺Fb亚群的功能

伤后4 d，与对照组比较，糖尿病组小鼠创面组织中CD34 ⁺Fb亚群1有267个显著上调的DEG（ P值均<0.05）和264个显著下调的DEG（ P值均<0.05）。显著上调的DEG显著富集条目包括对LPS的反应、细胞对IL-1的反应、TNF信号通路、IL-17信号通路等炎症反应相关通路（ P值均<0.05），显著下调的DEG显著富集的条目与ECM组装相关，包括ECM组装、胶原原纤维组装、细胞黏附、细胞-基质黏附、ECM、ECM结构成分、ECM受体相互作用等（ P值均<0.001）。见 图4。

注：对照组小鼠为CD34⁺细胞谱系追踪小鼠，糖尿病组小鼠为CD34⁺细胞谱系追踪糖尿病小鼠；KEGG为京都基因与基因组百科全书，GO为基因本体论，DEG为差异表达基因；图4A横坐标从左至右对应富集条目为破骨细胞分化、白细胞介素17（IL-17）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶信号通路、抗原处理和呈递、Janus激酶-信号转导及转录活化因子信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、核糖体、流体剪切应力与动脉粥样硬化、冠状病毒疾病-新型冠状病毒感染、蛋白质同源二聚活性、肽酶活性、金属内肽酶活性、相同蛋白质结合、蛋白酶结合、金属肽酶活性、肽酶抑制剂活性、核糖体的结构成分、受体结合、蛋白质结合、活化蛋白-1转录复合物、细胞外基质、核糖体、细胞表面、细胞核、核糖核蛋白复合体、细胞质、胞质核糖体、细胞外区、细胞外间隙、正调控血管生成、动物器官再生、肽酶活性的负调控、蛋白质加工、细胞对IL-1的反应、对肽酶激素的反应、细胞迁移的正向调节、对脂多糖的反应、细胞增殖的负调控、细胞翻译；图4B横坐标从左至右对应富集条目为阿米巴病、库欣综合征、EB病毒感染、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B信号通路、糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体信号通路、黏着斑、人乳头瘤病毒感染、癌症中的蛋白聚糖、细胞外基质受体相互作用、蛋白质的消化和吸收、肝素结合、蛋白酶结合、相同蛋白质结合、血小板衍生生长因子结合、整合素结合、钙离子结合、蛋白质结合、胶原结合、赋予拉伸强度的细胞外基质结构成分、细胞外基质结构成分、弹性纤维、内质网、细胞表面、肌膜、肌腱、基底膜、胶原三聚体、细胞外间隙、细胞外区、细胞外基质、炎症反应的负调控、成纤维细胞生长因子受体信号通路的负调控、细胞迁移、细胞对干扰素β的反应、胶原生物合成过程、细胞-基质黏附、创面修复、细胞黏附、胶原原纤维组装、细胞外基质组装

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伤后4 d，与对照组比较，糖尿病组小鼠创面组织中CD34 ⁺Fb亚群2有73个显著上调的DEG（ P值均<0.05）和32个显著下调的DEG（ P值均<0.05）。显著上调和下调的DEG富集条目较为相似，主要显著富集于细胞增殖调控、衰老和ECM相关条目（ P值均<0.05）；但显著上调的DEG在分子功能中显著富集于双链DNA结合、鸟苷三磷酸酶活性、序列特异性双链DNA结合等与DNA结合相关的条目（ P值均<0.05），显著下调的DEG则显著富集于生长因子结合、生长因子活性、肝素结合、钙离子结合等与生长因子相关的条目（ P值均<0.05）。见 图5。

注：对照组小鼠为CD34⁺细胞谱系追踪小鼠，糖尿病组小鼠为CD34⁺细胞谱系追踪糖尿病小鼠；KEGG为京都基因与基因组百科全书，GO为基因本体论，DEG为差异表达基因；图5A横坐标从左至右对应富集条目为癌症中的微小RNA、白细胞介素17信号通路、序列特异性双链DNA结合、肽酶活性、鸟苷三磷酸酶活性、金属肽酶活性、双链DNA结合、肝素结合、高密度脂蛋白颗粒、细胞外基质（ECM）、细胞外间隙、细胞外区、衰老、细胞对过氧化氢的反应、短期记忆、胶原原纤维组装、细胞增殖调控、细胞凋亡过程的正调控、正调控血管生成、对有机环状化合物的反应、对氧化应激的反应、细胞增殖的负调控；图5B横坐标从左至右对应富集条目为代谢途径、糖胺聚糖结合、肝素结合、钙离子结合、生长因子活性、胰岛素样生长因子结合、生长因子结合、ECM结构成分、基底膜、ECM、细胞外间隙、细胞外区、内皮细胞形态发生、细胞增殖的负调控、对维生素D的反应、钙离子转运的负调控、转化生长因子β产生的正调控、对糖皮质激素的反应、细胞对环腺苷酸的反应、细胞增殖的正向调节、ECM组装、衰老

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2.5 CD34 ⁺平滑肌细胞的功能

伤后4 d，与对照组比较，糖尿病组小鼠创面组织中CD34 ⁺平滑肌细胞有219个显著上调的DEG（ P值均<0.05）。这些DEG显著富集于细胞迁移、凋亡过程、转录的正调控（DNA模板）、信号肽处理等GO条目（ P值均<0.05），以及吞噬体、癌症中的发病途径、癌症中的蛋白聚糖等KEGG条目（ P值均<0.05）。见 图6。

注：对照组小鼠为CD34⁺细胞谱系追踪小鼠，糖尿病组小鼠为CD34⁺细胞谱系追踪糖尿病小鼠；KEGG为京都基因与基因组百科全书，GO为基因本体论；横坐标从左至右对应富集条目为内吞作用、流体剪切应力与动脉粥样硬化、人巨噬细胞感染、癌症中的蛋白聚糖、癌症中的发病途径、吞噬体、整合素结合、蛋白激素结合、肽酶活性、相同蛋白质结合、泛素-蛋白质连接酶结合、金属离子结合、前mRNA内含子结合、酶结合、细胞外基质结合、蛋白质结合、线粒体、RNA聚合酶Ⅱ转录因子复合物、核基质、高尔基膜、核糖核蛋白复合体、内质网、核、细胞质、核质、细胞溶质、神经元凋亡过程的正调控、神经元投射发育的负调控、细胞质微管组织、镁离子传输、细胞外基质组装、信号肽处理、转录的正调控（DNA模板）、骨骼系统发育、凋亡过程、细胞迁移

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2.6 CD34 ⁺KC的功能

伤后4 d，与对照组比较，糖尿病组小鼠创面组织中CD34 ⁺KC有1 391个差异表达显著的DEG（ P值均<0.05）。这些DEG显著富集于线粒体ATP合成偶联质子转运、线粒体呼吸链复合体Ⅰ组装、线粒体电子运输等与线粒体功能相关，以及转录的正调控（DNA模板）、DNA复制、单链DNA结合等与转录相关的GO条目（ P值均<0.05）；显著富集的KEGG条目主要为帕金森病、阿尔兹海默病等神经退行性疾病相关条目（ P值均<0.05）。见 图7。

注：对照组小鼠为CD34⁺细胞谱系追踪小鼠，糖尿病组小鼠为CD34⁺细胞谱系追踪糖尿病小鼠；KEGG为京都基因与基因组百科全书，GO为基因本体论；横坐标从左至右对应富集条目为非酒精性脂肪肝、糖尿病性心肌病、化学致癌-活性氧、氧化磷酸化、神经退行性变的途径、脊髓侧索硬化症、亨廷顿舞蹈症、阿尔兹海默病、帕金森病、朊病毒病、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（泛醌）活性、核苷酸活性、核酸结合、相同蛋白质结合、单链DNA结合、大分子复合物结合、酶结合、染色质结合、RNA结合、蛋白质结合、剪切体复合物、线粒体呼吸链复合体Ⅰ、呼吸链、核糖核蛋白复合体、细胞溶质、线粒体内膜、线粒体、细胞质、核质、细胞核、线粒体电子运输、DNA复制、核糖体RNA处理、信使RNA剪切（通过剪切体）、细胞周期、转录的正调控（DNA模板）、线粒体呼吸链复合体Ⅰ组装、有氧呼吸、RNA剪切、线粒体ATP合成偶联质子转运

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2.7 CD34 ⁺类软骨细胞的功能

伤后4 d，与对照组比较，糖尿病组小鼠创面组织中CD34 ⁺类软骨细胞有355个差异表达显著的DEG（ P值均<0.05）。这些DEG主要显著富集于节律过程、昼夜节律的调控等与节律调控相关，以及ECM、ECM结构成分结合等与ECM相关的GO条目（ P值均<0.05）；显著富集的KEGG条目主要为卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、爱泼斯坦-巴尔病毒感染等病毒感染相关条目（ P值均<0.05）。见 图8。

注：对照组小鼠为CD34⁺细胞谱系追踪小鼠，糖尿病组小鼠为CD34⁺细胞谱系追踪糖尿病小鼠；KEGG为京都基因与基因组百科全书，GO为基因本体论；横坐标从左至右对应富集条目为阿米巴病、化学致癌-活性氧、糖尿病并发症中晚期糖基化终末产物（AGE）-AGE受体信号、内吞作用、流体剪切应力与动脉粥样硬化、抗原处理和呈递、糖尿病性心肌病、癌症中的蛋白聚糖、爱泼斯坦-巴尔病毒感染、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、染色体DNA结合、整合素结合、细胞外基质（ECM）结构成分、肽酶活性、相同蛋白质结合、酶结合、泛素蛋白连接酶结合、胶原结合、大分子复合物结合、蛋白质结合、核内小体、大分子化合物、核糖核蛋白复合体、细胞表面、细胞外区、早期内膜体、ECM、核质、细胞质、细胞核、自然杀伤细胞介导的细胞毒性的保护、对过氧化氢的反应、蛋白质磷酸化的正调控、细胞迁移的正向调控、基因表达的昼夜节律调节、染色质组装、昼夜节律的调控、内皮细胞迁移的正调控、转录的负调控（DNA模板）、节律过程

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3.   讨论

小鼠全层皮肤缺损伤后4 d是炎症末期，并开始进入修复和重建阶段，此阶段包括血管生成、Fb增殖和新组织形成等过程，CD34 ⁺细胞在伤后4 d的创面组织中高表达 ^{［ 6， 12］} 。本研究结果表明，伤后4 d CD34 ⁺细胞可以分为7种细胞类型，并且Fb可细分为5个亚群。对比本课题组前期研究的伤后1 d CD34 ⁺细胞的单细胞测序结果 ^{［ 9］} ，出现了CD34 ⁺平滑肌细胞和类软骨细胞，这与CD34 ⁺细胞在创面愈合过程中的增殖分化相关。伤后4 d，2组小鼠创面组织中Fb亚群1和Fb亚群2占比高且创面间细胞占比差异大，这可能与糖尿病创面高血糖环境相关；此外，KC是创面愈合的主要结构成分。因此，本课题组选择研究CD34 ⁺Fb亚群1、Fb亚群2、平滑肌细胞、类软骨细胞和KC这5种细胞在2组小鼠创面组织中的功能差异。

CD34 ⁺Fb亚群1高表达基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶11，基质金属蛋白酶不仅参与降解ECM，还是炎症与先天免疫的调节剂。此外，此细胞亚群高表达基因Fcγ受体Ⅱb是Igγ复合体Fc区的低亲和力受体，是胶质瘤的预后和免疫微环境标志物 ^{［ 13］} ；羧肽酶X-M14家族成员1与肿瘤免疫细胞浸润相关。因此，CD34 ⁺Fb亚群1具有ECM组装和免疫调节双重功能。在糖尿病创面中，此细胞亚群上调表达炎症因子相关基因，下调表达ECM组装相关基因，可能引起此亚群细胞的ECM组装和免疫调节双重功能失调，导致创面愈合延迟。

与对照组比较，CD34 ⁺Fb亚群2在糖尿病组小鼠创面组织中的占比下调。与Ⅰ型胶原蛋白（collagen type I，COL1）合成相关的 COL1A2、 COL1A1基因在此细胞亚群中高表达。与对照组比较，在糖尿病组小鼠创面组织中显著上调的DEG显著富集于DNA结合相关条目，显著下调的DEG显著富集于生长因子相关条目。 COL1A2和 COL1A1是生长因子重要的调控基因， COL1A1可在表观遗传学、转录、转录后和翻译后调节DNA甲基转移酶、 TGF- β ₁ 、末端核苷酸转移酶5A和骨形成蛋白1等 ^{［ 14］} 。因此，此细胞亚群在糖尿病创面中占比下调可能与 COL1A2和 COL1A1功能变化相关。

肌Fb是可收缩的表达α平滑肌肌动蛋白的细胞，介导创面收缩，并且是驱动纤维化的核心；纤维化过程中Fb-肌Fb分化是瘢痕组织失调和过度产生的关键 ^{［ 15］} 。因此，肌Fb是创面和瘢痕治疗的重要细胞靶点。平滑肌细胞同样也表达α平滑肌肌动蛋白，并与肌Fb在分化谱系、结构和功能上相似 ^{［ 16］} 。CD34 ⁺平滑肌细胞标记基因 RGS5在血管重塑过程中是调节血管平滑肌细胞反应的关键因素 ^{［ 17］} ； RGS5是膀胱癌中肿瘤相关Fb生物标志物，具有肌Fb特性和胶原沉积功能 ^{［ 18］} 。此外，CD34 ⁺平滑肌细胞中高表达基因Notch受体3和肌球蛋白重链11等也与肌Fb分化和瘢痕形成相关。在糖尿病组小鼠创面组织中CD34 ⁺平滑肌细胞显著上调的DEG显著富集于细胞迁移、凋亡过程、转录的正调控（DNA模板）、信号肽处理、吞噬体等条目，这些功能在糖尿病创面中的改变可能引起肌Fb分化异常以及增加瘢痕形成风险。

与对照组比较，糖尿病组小鼠创面组织中CD34 ⁺KC的DEG功能主要与线粒体功能以及转录相关。线粒体代谢可以调节KC分化，线粒体产生活性氧簇可促进表皮分化和毛囊发育 ^{［ 19］} 。此外，CD34 ⁺KC标记基因角蛋白6a等会调节线粒体形态、动力学和功能。因此，糖尿病全层皮肤缺损创面中CD34 ⁺KC线粒体功能可能发生紊乱，影响KC的分化和相关功能。KEGG富集分析显示，2组小鼠创面组织间CD34 ⁺KC的DEG显著富集于神经退行性疾病相关条目。神经系统和表皮均由胚胎的外胚层发育而来，α-突触核蛋白、tau蛋白和β-淀粉样34等神经退行性疾病致病基因也定位于表皮层，并与衰老相关 ^{［ 20］} 。因此，这些神经退行性疾病相关基因在糖尿病创面中的异常表达也可能引起KC功能的异常。

间充质干细胞在体外具有明确的成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等多谱系分化能力。皮肤中部分CD34 ⁺细胞具有干细胞特性，也具有多谱系分化潜能。虽然CD34 ⁺细胞在骨髓中可以分化成软骨细胞，但暂时未有其在皮肤中分化成软骨细胞的报道 ^{［ 21］} 。2组小鼠创面组织间CD34 ⁺类软骨细胞的DEG功能主要与节律调控和ECM相关。正常的节律基因振荡表达对于维持软骨基质和软骨节奏至关重要，异常的节律基因表达将导致间充质干细胞诱导软骨发生和特异性的软骨ECM分子的沉积异常 ^{［ 22］} 。因此，CD34 ⁺类软骨细胞在糖尿病创面中占比升高可能是由CD34 ⁺细胞分化异常导致的。

本研究从单细胞角度系统地描述了CD34 ⁺细胞在普通小鼠和糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面中的类型和功能，从新角度加深了对创面愈合机制的理解，并为临床应用CD34 ⁺细胞治疗糖尿病创面提供了理论依据。后续，本课题组拟尝试研究能否通过改变CD34 ⁺细胞在糖尿病创面中的细胞亚群组成比例促进创面愈合。