Analysis of the types and functions of CD34 + cells in full-thickness skin defect wounds of normal mice and diabetic mice by single-cell RNA sequencing
-
摘要:
目的 单细胞RNA测序解析普通小鼠和糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面中CD34 +细胞的类型与功能。 方法 该研究为实验研究。构建CD34 +细胞谱系追踪小鼠，实现CD34 +细胞在荧光条件下可视化。取6只7~8周龄雄性CD34 +细胞谱系追踪小鼠（设为糖尿病组），腹腔注射链脲佐菌素构建糖尿病模型，于小鼠13周龄时在其背部制备全层皮肤缺损创面；另取6只13周龄雄性CD34 +细胞谱系追踪小鼠（设为对照组），在其背部制备全层皮肤缺损创面。伤后4 d，分别收集对照组3只小鼠和糖尿病组2只小鼠创面组织，消化制备单细胞悬液，采用荧光活化细胞分选法筛选出CD34 +细胞后进行单细胞RNA测序，采用R语言的Seurat 4.0.2程序通过降维可视化和细胞聚类分析CD34 +细胞类型并筛选注释各CD34 +细胞亚群的标记基因，对2组小鼠创面组织间CD34 +成纤维细胞（Fb）、平滑肌细胞、角质形成细胞（KC）、类软骨细胞的差异表达基因（DEG）进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因本体论（GO）富集分析，探索细胞功能。 结果 伤后4 d，2组小鼠创面组织中CD34 +细胞均包含7种细胞类型，具体为内皮细胞、Fb、KC、巨噬细胞、T细胞、平滑肌细胞和类软骨细胞，其中Fb细分为5个亚群。与对照组比较，糖尿病组小鼠创面组织中的CD34 +内皮细胞、Fb亚群1、Fb亚群4、KC、类软骨细胞占比升高，CD34 +Fb亚群2、Fb亚群3和平滑肌细胞占比下降。注释CD34 +类软骨细胞、内皮细胞、Fb亚群1、Fb亚群2、Fb亚群3、Fb亚群4、Fb亚群5、KC、巨噬细胞、平滑肌细胞、T细胞的标记基因分别为转移相关肺腺癌转录本1、脂肪酸结合蛋白4、Gremlin 1、补体成分4B、H19印记母源表达转录本、Dickkopf Wnt信号通路抑制剂2、纤维调节蛋白、角蛋白5、CD74分子、G蛋白信号调节蛋白5、可诱导T细胞共刺激分子。KEGG和GO富集分析显示，与对照组比较，糖尿病组小鼠伤后4 d创面组织中CD34 +Fb差异表达显著的DEG显著富集于炎症反应、细胞外基质（ECM）组装、细胞增殖调控、衰老相关条目（ P值均<0.05），CD34 +平滑肌细胞差异表达显著的DEG显著富集于细胞迁移、凋亡过程、转录的正调控、吞噬体等条目（ P值均<0.05），CD34 +KC差异表达显著的DEG显著富集于线粒体功能、转录、神经退行性疾病相关条目（ P值均<0.05），CD34 +类软骨细胞差异表达显著的DEG显著富集于节律调控、ECM、病毒感染等相关条目（ P值均<0.05）。 结论 CD34 +细胞在普通小鼠和糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面愈合过程中均存在高异质性，2种小鼠创面间CD34 +细胞亚群差异表达显著的DEG显著富集的相关功能与创面愈合过程紧密相关。 Abstract:Objective To analyze the types and functions of CD34 + cells in full-thickness skin defect wounds of normal mice and diabetic mice by single-cell RNA sequencing. Methods This study was an experimental study. The CD34 + cell lineage tracing mouse was produced, and the visualization of CD34 + cells under the fluorescent condition was realized. Six male CD34 + cell lineage tracing mice aged 7-8 weeks (designated as diabetic group) were intraperitoneally injected with streptozotocin to establish a diabetic model, and full-thickness skin defect wounds were prepared on their backs when they reached 13 weeks old. Another 6 male CD34 + cell lineage tracing mice aged 13 weeks (designated as control group) were also subjected to full-thickness skin defect wounds on their backs. On post-injury day (PID) 4, wound tissue was collected from 3 mice in control group and 2 mice in diabetic group, and digested to prepare single-cell suspensions. CD34 + cells were screened using fluorescence-activated cell sorting, followed by single-cell RNA sequencing. The Seurat 4.0.2 program in the R programming language was utilized for dimensionality reduction, visualization, and cell clustering analysis of CD34 + cell types, and to screen and annotate the marker genes for each CD34 + cell subpopulation. Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) and gene ontology (GO) enrichment analysis was performed to analyze the differentially expressed genes (DEGs) of CD34 + fibroblasts (Fbs), smooth muscle cells (SMCs), keratinocytes (KCs), and chondrocyte-like cells (CLCs) in the wound tissue of two groups of mice for exploring cellular functions. Results On PID 4, CD34 + cells in the wound tissue of both groups of mice were consisted of 7 cell types, specifically endothelial cells, Fbs, KCs, macrophages, T cells, SMCs, and CLCs. Among these, Fbs were further classified into 5 subpopulations. Compared with those in control group, the proportions of CD34 + endothelial cells, Fbs subpopulation 1, Fbs subpopulation 4, KCs, and CLCs in the wound tissue of mice were increased in diabetic group, while the proportions of CD34 + Fbs subpopulation 2, Fbs subpopulation 3, and SMCs were decreased. The marker genes for annotating CD34 + CLCs, endothelial cells, Fbs subpopulation 1, Fbs subpopulation 2, Fbs subpopulation 3, Fbs subpopulation 4, Fbs subpopulation 5, KCs, macrophages, SMCs, and T cells were respectively metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1, fatty acid binding protein 4, Gremlin 1, complement component 4B, H19 imprinted maternally expressed transcript, Dickkopf Wnt signaling pathway inhibitor 2, fibromodulin, keratin 5, CD74 molecule, regulator of G protein signaling 5, and inducible T-cell co-stimulator molecule. KEGG and GO enrichment analysis revealed that, compared with those in control group, DEGs with significant differential expression (SDE) in CD34 + Fbs from the wound tissue of mice in diabetic group on PID 4 were significantly enriched in terms related to inflammatory response, extracellular matrix (ECM) organization, regulation of cell proliferation, and aging (with Pvalues all <0.05), DEGs with SDE in CD34 + SMCs were significantly enriched in terms related to cell migration, apoptotic process, positive regulation of transcription, and phagosome (with P values all <0.05), DEGs with SDE in CD34 + KCs were significantly enriched in terms related to mitochondrial function, transcription, and neurodegenerative diseases (with P values all <0.05), and DEGs with SDE in CD34 + CLCs were significantly enriched in terms related to rhythm regulation, ECM, and viral infection (with P values all <0.05). Conclusions CD34 + cells display high heterogeneity in the healing process of full-thickness skin defect wounds in both normal mice and diabetic mice. The significantly enriched functions of DEGs with SDE in CD34 + cell subpopulations in the wound tissue of the two mouse groups are closely related to the wound healing process. -
Key words:
- Wound healing /
- Skin /
- CD34 /
- Single-cell RNA sequencing /
- Cell subpopulations /
- Marker genes /
- Cellular heterogeneity /
- Cell function
-
本文亮点：
(1)证实人脂肪间充质干细胞（ADSC）外泌体可改善内毒素/脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞线粒体功能障碍,抑制巨噬细胞持续向M1型极化,减轻炎症反应。
(2)证实人ADSC外泌体可改善脓毒症小鼠急性肺损伤,减轻氧化应激、炎症反应,该作用可能通过调节巨噬细胞线粒体功能来实现。
Highlights:
(1)It was confirmed that human adipose mesenchymal stem cells (ADSC)-derived exosomes could improve lipopolysaccharide-induced mitochondrial dysfunction in mouse macrophages, inhibit the continuous polarization of macrophages toward M1, and reduce the inflammatory response.
(2)It was confirmed that human ADSC-exosomes could improve acute lung injury in septic mice, and alleviate oxidative stress and inflammatory response. This effect might be achieved by regulating the mitochondrial function of macrophages.
急性肺损伤（acute lung injury,ALI）或其严重形式的ARDS在大面积烧伤、危重多发伤、脓毒症等危重患者中较为常见,其特征是存在持续的肺部炎症和弥漫性肺泡损伤[1, 2, 3, 4]。巨噬细胞广泛分布于肺组织。在ALI早期阶段,巨噬细胞响应外源性微生物刺激,被迅速激活,随后通过产生多种细胞因子和向肺部招募更多的其他巨噬细胞及中性粒细胞等炎症细胞的形式促进炎症的持续发展,最终导致肺损伤[5, 6, 7, 8]。研究显示,线粒体功能障碍在巨噬细胞持续向M1型极化的过程中处于关键地位。在ALI、ARDS等多种疾病的发生发展中,线粒体功能障碍参与了过度炎症反应和活性氧过度产生[9, 10, 11, 12]。因此,在炎症早期围绕通过调控巨噬细胞线粒体功能障碍来控制巨噬细胞持续向M1型极化、过度炎症反应的研究,可能成为治疗ALI及ARDS的一种有效策略。
脂肪间充质干细胞（adipose mesenchymal stem cell,ADSC）是干细胞家族的重要成员,具有强大的免疫调节和抗炎能力,且易于获得[13, 14, 15]。近年来,大量研究表明,间充质干细胞分泌的可溶性因子和外泌体可以替代细胞作为抑制炎症和促进组织修复的选择[16, 17, 18, 19]。本研究通过对小鼠进行盲肠结扎穿孔（cecal ligation and puncture,CLP）来诱发ALI从而构建脓毒症动物模型,并采用人ADSC外泌体进行干预,旨在探究人ADSC外泌体对脓毒症小鼠ALI的潜在作用及分子机制。
1. 材料与方法
本实验研究遵循空军军医大学动物实验伦理委员会和国家有关实验动物管理和使用的规定。
1.1 动物和细胞及主要试剂与仪器来源
24只健康无特殊病原体级成年雄性BALB/c小鼠（体重21~26 g）由空军军医大学动物中心提供,许可证号：SYXK（军）2012-0022。人ADSC为本实验室冻存细胞,RAW264.7小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系购自美国典型培养物保藏中心。
DMEM/F12、RPMI-1640培养基、无外泌体胎牛血清购自美国Gibco公司,ADSC专用培养基购自广州赛业生物科技有限公司,总mRNA提取试剂盒、ATP含量检测试剂盒、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体、线粒体超氧化物（mitochondrial superoxide,MitoSOX）检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒（荧光基团为JC-1）购自上海碧云天生物技术有限公司,反转录试剂盒及PCR检测试剂盒购自日本Takara公司,40 g/L多聚甲醛、HE染色试剂盒购自武汉赛维尔生物科技有限公司,丙二醛（脂质过氧化产物）和SOD（自由基代谢产物）检测试剂盒购自南京建成生物科技有限公司,一步法原位末端标记（TdT-mediated-dUTP nick-end labeling,TUNEL）细胞凋亡检测试剂盒（荧光基团为异硫氰酸荧光素）购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司,多聚-D-赖氨酸、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）、外泌体示踪染料PKH26红色荧光细胞连接试剂盒购自美国Sigma公司,兔抗小鼠CD86（M1型巨噬细胞标志物）单克隆抗体、兔抗小鼠CD206（M2型巨噬细胞标志物）单克隆抗体和异硫氰酸荧光素标记的兔抗人CD9单克隆抗体、兔抗人CD63单克隆抗体、兔抗人CD81单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司,小鼠TNF-α、IL-1β的ELISA试剂盒购自美国Becton Dickinson公司。
FACS AriaⅢ型流式细胞仪购自美国Becton Dickinson公司,二氧化碳培养箱购自美国Thermo Fisher Scientific公司,Optima™XPN型超高速离心机购自美国Beckman公司,Infinite M200 Pro型全波长多功能酶标仪购自瑞士TECAN公司,HT-7700型透射电子显微镜购自日本Hitachi公司,EVOS FL Auto 2型激光扫描共聚焦显微镜购自美国Invitrogen公司,FSX100型全自动生物图像导航仪购自日本Olympus公司,IQ5TM型实时荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司。
1.2 人ADSC外泌体的分离提取及表征
取人ADSC,采用ADSC专用培养基进行常规培养,选用第4或第5代细胞进行后续实验。参照文献[20]采用差速超高速离心法制备人ADSC外泌体,调整其质量浓度为2 μg/mL备用。采用透射电子显微镜在40 000倍放大倍数下观察外泌体形态,采用纳米颗粒跟踪分析仪检测外泌体粒径。常规采用流式细胞仪检测外泌体CD9、CD63、CD81阳性率,其中抗体为异硫氰酸荧光素标记的兔抗人CD9、CD63、CD81单克隆抗体（稀释比均为1∶200）。
1.3 动物实验
1.3.1 脓毒症小鼠模型的建立及分组与样本收集
取24只BALB/c小鼠,适应性饲养1周后按照随机数字表法（分组方法下同）分成正常对照组、单纯CLP组和CLP+ADSC外泌体组,每组8只。单纯CLP组和CLP+ADSC外泌体组小鼠均行CLP手术建立脓毒症模型[21, 22]。CLP术后2 h,对CLP+ADSC外泌体组小鼠行尾静脉注射100 μL由1.2制备的外泌体,单纯CLP组小鼠尾静脉注射等量无菌PBS。同时,正常对照组小鼠仅尾静脉注射等量无菌PBS。术后24 h（正常对照组小鼠取注射PBS后相同时间点）,参照文献[23, 24, 25],摘除小鼠眼球,取血备用；然后用颈椎脱臼法处死小鼠,将左肺置于冰上备用,将右肺采用40 g/L多聚甲醛固定,常规石蜡包埋,制成厚度为5 μm切片备用。
1.3.2 肺组织的形态学观察及细胞凋亡情况检测
取1.3.1中切片,常规行HE染色并采用全自动生物图像导航仪于激光扫描共聚焦显微镜100倍镜下观察肺组织形态。另取切片,按TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书进行染色（阳性染色为绿色）,并用DAPI复染细胞核（阳性染色为蓝色）,然后于激光扫描共聚焦显微镜100倍放大倍数下观察肺组织细胞凋亡情况。
1.3.3 血清中炎症因子水平的检测
取1.3.1中的血标本,冰上静置30 min后于4 ℃条件下以1 600×g 离心15 min,小心吸取上层血清,按照ELISA试剂盒说明书步骤检测血清中的TNF-α和IL-1β含量。样本数为4。
1.3.4 肺组织的氧化应激水平检测
取1.3.1中小鼠肺组织,剪碎并裂解肺组织收集肺组织匀浆液。参照丙二醛和SOD检测试剂盒说明书,采用酶标仪分别于534 nm波长和452 nm波长处测定匀浆液的吸光度值,反映丙二醛和SOD含量。样本数为4。
1.3.5 肺组织中巨噬细胞表型的检测
取1.3.1中切片,进行抗原修复后常规进行免疫组织化学染色,一抗为兔抗小鼠CD86、CD206单克隆抗体（稀释比均为1∶100）,二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体（稀释比为1∶200）,用苏木素染细胞核。在激光扫描共聚焦显微镜100倍放大倍数下观察阳性细胞占比情况。目标蛋白阳性染色为棕色,细胞核阳性染色为蓝色。样本数为4。
1.4 细胞实验
1.4.1 RAW264.7细胞对外泌体的内化情况
取100 μL由1.2制备的外泌体,加入4 μL的PKH26标记的细胞连接试剂,室温避光孵育5 min后,4 ℃、100 000×g离心1 h,获取沉淀,然后采用100 μL PBS重新悬浮备用。
调整RAW264.7细胞浓度为5×104个/mL,按照每孔100 μL接种于96孔板,培养至细胞融合达70%。取前述20 μL PKH26标记的人ADSC外泌体悬液,加到RAW264.7细胞培养液中,避光共培养12 h后用PBS清洗3次。用40 g/L多聚甲醛固定15 min,用DAPI染细胞核。在激光扫描共聚焦显微镜200倍放大倍数下观察细胞对PKH26标记的人ADSC外泌体的吞噬情况。外泌体阳性染色为红色,细胞核阳性染色为蓝色。
1.4.2 LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型及分组处理
取RAW264.7细胞,采用含体积分数10%无外泌体胎牛血清的RPMI-1640培养基常规进行细胞培养,待细胞生长至80%融合时,将细胞分为空白对照组、单纯LPS组和LPS+ADSC外泌体组。在LPS+ADSC外泌体组细胞培养基中先加入终质量浓度50 μg/mL人ADSC外泌体预孵育1 h,然后参照文献[26]进行LPS刺激；对单纯LPS组细胞仅进行同前的LPS刺激；对空白对照组细胞进行常规培养。
1.4.3 RAW264.7细胞中ATP含量检测
取1.4.2分组培养12 h后的细胞,根据ATP含量检测试剂盒说明书测定ATP量。样本数为4。
1.4.4 RAW264.7细胞中线粒体活性氧的检测
取1.4.2分组培养12 h后的细胞,加入5 μmol/L MitoSOX试剂孵育30 min,PBS洗涤3次后用流式细胞仪收集细胞。采用flowJo软件统计MitoSOX荧光强度并计算其阳性细胞百分比,反映细胞内线粒体活性氧的阳性细胞百分比。样本数为4。
1.4.5 RAW264.7细胞线粒体膜电位的检测
取1.4.2分组培养12 h后的细胞,根据线粒体膜电位检测试剂盒说明书加入含探针的试剂（稀释比为1∶1 000）,37 ℃避光孵育30 min。PBS洗涤3次,离心后弃上清液,加PBS重新悬浮细胞,采用全自动生物图像导航仪于激光扫描共聚焦显微镜200倍放大倍数下拍照,检测荧光情况。若呈现红色荧光则说明线粒体正常,即JC-1聚集在线粒体基质中形成聚合物；若呈现绿色荧光则说明线粒体膜电位下降或线粒体受损,即JC-1只能以单体的形式存在于细胞质中。样本数为4。
1.4.6 RAW264.7细胞M1/M2型极化标志因子及炎症因子的mRNA表达量检测
取1.4.2分组培养后12 h的细胞,提取总mRNA,采用实时荧光定量RT-PCR法检测巨噬细胞M1、M2型极化标志因子诱导型NOS（inducible nitric oxide synthase,iNOS）和精氨酸酶-1（arginase-1,Arg1）,炎症因子TNF-α和IL-1β的mRNA表达,引物序列见表1。按照荧光定量试剂盒说明书,以GAPDH为内参照,通过2-ΔΔCt法对TNF-α、IL-1β、iNOS和Arg1的mRNA表达进行定量分析。样本数为3。
Table 1. 实时荧光定量反转录PCR法检测RAW264.7细胞的各引物序列及产物大小基因名称 引物序列（5'→3'） 产物大小（bp） IL-1β 上游：TCCAGGATGAGGACATGAGCAC 105 下游：GAACGTCACACACCAGCAGGTTA iNOS 上游：ACTACTGCTGGTGGTGACAA 106 下游：GAAGGTGTGGTTGAGTTCTCTAAG TNF-α 上游：ACTCCAGGCGGTGCCTATGT 160 下游：GTGAGGGTCTGGGCCATAGAA Arg1 上游：ACATTGGCTTGCGAGACGTA 109 下游：ATCACCTTGCCAATCCCCAG GAPDH 上游：TGTGTCCGTCGTGGATCTGA 150 下游：TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG 注：IL为白细胞介素,iNOS为诱导型一氧化氮合酶,TNF为肿瘤坏死因子,Arg1为精氨酸酶-1,GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶 1.5 统计学处理
采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。计量资料数据均符合正态分布,以
2. 结果
2.1 人ADSC外泌体的表征
人ADSC外泌体呈茶托状结构,粒径分布在60~150 nm之间,见图1。人ADSC外泌体的CD9、CD63、CD81阳性率分别为（17.2±2.7）%、（15.4±1.4）%、（22.8±1.1）%。
图 1 人脂肪间充质干细胞外泌体的表征。1A.可见囊泡呈清晰的茶托状结构 透射电子显微镜×40 000；1B.纳米颗粒跟踪分析仪检测显示粒径为60~150 nm注：图1B为横坐标经过lg处理的数据形成的描记图2.2 人ADSC外泌体对CLP小鼠ALI的影响
2.2.1 对肺组织损伤的影响
术后24 h,正常对照组小鼠肺组织结构清晰完整,肺泡连接紧密、无炎症细胞浸润,肺间质较薄、无出血；单纯CLP组较正常对照组小鼠的肺组织水肿明显,炎症细胞浸润现象明显,凋亡、坏死细胞明显增多；CLP+ADSC外泌体组较单纯CLP组小鼠肺组织水肿症状明显减轻,炎症细胞浸润明显减少,细胞凋亡、坏死情况明显改善。见图2。
图 2 3组小鼠术后24 h肺组织损伤情况和肺组织细胞的凋亡情况。2A、2B、2C.分别为正常对照组、单纯CLP组、CLP+ADSC外泌体组小鼠肺组织损伤情况,图2B较图2A中的肺组织水肿情况明显,炎症细胞数明显增多,图2C较图2B肺组织水肿明显改善,炎症细胞数明显减少 苏木精-伊红×100；2D、2E、2F.分别为正常对照组、单纯CLP组、CLP+ADSC外泌体组小鼠肺组织细胞的凋亡情况,图2E较图2D中的凋亡、坏死细胞数明显增加,图2F较图2E凋亡、坏死细胞数明显减少 异硫氰酸荧光素-4',6-二脒基-2-苯基吲哚×100注：对单纯盲肠结扎穿孔（CLP）组小鼠行CLP后注射磷酸盐缓冲液,对CLP+脂肪间充质干细胞（ADSC）外泌体组小鼠进行组名相应的处理,对正常对照组小鼠仅注射磷酸盐缓冲液；凋亡细胞阳性染色为绿色,细胞核阳性染色为蓝色2.2.2 对炎症反应的影响
术后24 h,正常对照组、单纯CLP组和CLP+ADSC外泌体组小鼠血清中TNF-α含量分别为（76±4）、（362±11）、（221±14）pg/mL,IL-1β含量分别为（43±4）、（163±6）、（74±7）pg/mL,组间总体比较,差异有统计学意义（F值分别为793.40、437.00,P值均<0.001）。与正常对照组比较,单纯CLP组小鼠血清中TNF-α和IL-1β含量均明显增加（t值分别为50.82、30.81,P<0.001）；与单纯CLP组比较,CLP+ADSC外泌体组小鼠血清中的TNF-α和IL-1β含量均明显降低（t值分别为16.36、19.25,P<0.001）。
2.2.3 对肺组织氧化应激水平的影响
术后24 h,正常对照组、单纯CLP组和CLP+ADSC外泌体组小鼠肺组织匀浆液中丙二醛含量分别为（1.57±0.10）、（4.46±0.58）、（2.65±0.59）μmol/g,SOD含量分别为（64±7）、（37±8）、（53±7）U/g,组间总体比较,差异有统计学意义（F值分别为36.99、13.17,P值均<0.001）。与正常对照组比较,单纯CLP组小鼠肺组织中丙二醛含量明显升高（t=9.89,P<0.001）,SOD含量明显降低（t=5.01,P=0.002）；与单纯CLP组比较,CLP+ADSC外泌体组小鼠肺组织中丙二醛含量明显降低（t=4.38,P=0.005）,SOD含量明显升高（t=2.97,P=0.025）。
2.2.4 对肺组织中巨噬细胞表型的影响
术后24 h,与正常对照组相比,单纯CLP组小鼠的肺组织中CD86阳性细胞占比明显升高,CD206阳性细胞占比明显减少；与单纯CLP组相比,CLP+ADSC外泌体组小鼠肺组织中CD86阳性细胞占比明显减少,CD206阳性细胞占比明显升高。见图3。
图 3 3组小鼠术后24 h肺组织中巨噬细胞浸润及分化情况 辣根过氧化物酶-苏木素×100。3A、3B、3C.分别为正常对照组、单纯CLP组、CLP+ADSC外泌体组CD86（M1型巨噬细胞标志物）阳性细胞分布情况,图3B较图3A中的M1型巨噬细胞占比明显升高,图3C较图3B中的M1型巨噬细胞占比明显减少；3D、3E、3F.分别为正常对照组、单纯CLP组、CLP+ADSC外泌体组CD206（M2型巨噬细胞标志物）阳性细胞分布情况,图3E较图3D中的M2型巨噬细胞占比明显减少,图3F较图3E中的M2型巨噬细胞占比明显升高注：对单纯盲肠结扎穿孔（CLP）组小鼠行CLP后注射磷酸盐缓冲液,对CLP+脂肪间充质干细胞（ADSC）外泌体组小鼠进行组名相应的处理,对正常对照组小鼠仅注射磷酸盐缓冲液；细胞阳性染色均为棕色,细胞核阳性染色为蓝色2.3 人ADSC外泌体对RAW264.7细胞的影响
2.3.1 RAW264.7细胞内化人ADSC外泌体的情况
共培养12 h后,人ADSC外泌体成功被RAW264.7细胞吞入细胞质,见图4。
图 4 共培养12 h后RAW264.7细胞吞噬人脂肪间充质干细胞（ADSC）外泌体的情况 PKH26-4',6-二脒基-2-苯基吲哚×200。4A、4B、4C.分别为细胞中的外泌体染色、细胞核染色及复合染色情况,可见人ADSC外泌体成功被RAW264.7细胞吞噬注：人ADSC外泌体阳性染色为红色,细胞核阳性为蓝色2.3.2 人ADSC外泌体对RAW264.7细胞中ATP含量的影响
培养12 h后,空白对照组、单纯LPS组和LPS+ADSC外泌体组细胞中ATP含量分别为（13.8±1.5）、（7.9±1.2）、（12.5±2.0）nmol/mg,组间总体比较,差异有统计学意义（F=15.48,P=0.001）。与空白对照组比较,单纯LPS组细胞中ATP含量明显降低（t=6.28,P<0.001）；与单纯LPS组比较,LPS+ADSC外泌体组细胞中ATP含量明显升高（t=4.01,P=0.007）。
2.3.3 人ADSC外泌体对RAW264.7细胞线粒体活性氧的影响
培养12 h后,空白对照组、单纯LPS组和LPS+ADSC外泌体组细胞中线粒体活性氧的阳性细胞百分比分别为（22±4）%、（40±6）%、（30±5）%,组间总体比较,差异有统计学意义（F=12.61,P=0.002）。与空白对照组比较,单纯LPS组细胞中线粒体活性氧的阳性细胞百分比明显增加（t=5.04,P=0.002）；与单纯LPS组比较,LPS+ADSC外泌体组细胞中线粒体活性氧的阳性细胞百分比明显降低（t=2.65,P=0.038）。
2.3.4 人ADSC外泌体对RAW264.7细胞线粒体膜电位的影响
培养12 h后,与空白对照组相比,单纯LPS组细胞的线粒体膜电位明显降低；LPS+ADSC外泌体组细胞的线粒体膜电位介于空白对照组和单纯LPS组之间。见图5。
图 5 培养12 h后3组RAW264.7细胞中线粒体膜电位情况 JC-1×200。5A、5B、5C、5D.分别为空白对照组细胞呈蓝色荧光、绿色荧光、红色荧光及复合显色情况；5E、5F、5G、5H.分别为单纯LPS组细胞呈蓝色荧光、绿色荧光、红色荧光及复合显色情况；5I、5J、5K、5L.分别为LPS+ADSC外泌体组细胞呈蓝色荧光、绿色荧光、红色荧光及复合显色情况,图5F较图5B中的线粒体膜电位下降明显,图5J中的线粒体膜电位介于图5B与图5F之间,图5K中的正常线粒体荧光强度介于图5C与图5G之间注：在内毒素/脂多糖（LPS）+脂肪间质干细胞（ADSC）外泌体组和单纯LPS组细胞中分别加入LPS+ADSC外泌体、LPS进行培养,对空白对照组细胞进行常规培养；细胞核阳性染色为蓝色,受损或膜电位下降的线粒体阳性染色为绿色,正常线粒体阳性染色为红色2.3.5 人ADSC外泌体对RAW264.7细胞M1/M2型标志因子及炎症因子的影响
培养12 h后,空白对照组、单纯LPS组和LPS+ADSC外泌体组细胞中TNF-α、IL-1β、iNOS、Arg1的mRNA表达量组间总体比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。与空白对照组比较,单纯LPS组细胞中TNF-α、IL-1β、iNOS的mRNA表达量均明显升高（P<0.05）,Arg1的mRNA表达量降低但差异无统计学意义（P>0.05）；与单纯LPS组比较,LPS+ADSC外泌体组细胞中TNF-α、IL-1β、iNOS的mRNA表达量均明显降低（P<0.05）,Arg1的mRNA表达量明显升高（P<0.05）。见表2。
Table 2. 培养12 h后3组RAW264.7细胞M1/M2型极化标志因子及炎症因子的mRNA表达量比较（组别 样本数 TNF-α IL-1β Arg1 iNOS 空白对照组 3 1.01±0.17 1.00± 0.09 1.00±0.05 1.00±0.04 单纯LPS组 3 85.60±8.87 1 648.67± 91.95 0.84±0.10 2.46±0.33 LPS+ADSC外泌体组 3 23.03±3.47 382.33± 31.26 1.35±0.07 1.44±0.07 F值 190.96 709.92 36.50 44.67 P值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 t1值 16.51 31.04 2.40 7.70 P1值 <0.001 <0.001 0.077 <0.001 t2值 11.38 22.58 7.66 5.28 P2值 <0.001 <0.001 0.002 0.006 注：在内毒素/脂多糖（LPS）+脂肪间质干细胞（ADSC）外泌体组和单纯LPS组细胞中分别加入LPS+ADSC外泌体、LPS进行培养,对空白对照组细胞进行常规培养；IL为白细胞介素,iNOS为诱导型一氧化氮合酶,TNF为肿瘤坏死因子,Arg1为精氨酸酶-1；F值、P值为组间总体比较所得,t1值、P1值为空白对照组与单纯LPS组各指标比较所得,t2值、P2值为单纯LPS组与LPS+ADSC外泌体组各指标比较所得 3. 讨论
ALI是脓毒症患者常见的并发症之一,属于临床常见的危重症,发病急、致死率高[27, 28, 29, 30, 31]。其特征是肺泡上皮细胞和内皮细胞损伤、肺部炎症细胞浸润及充血性水肿等,严重感染、创伤后的肺部或全身不可控的炎症是主要发病诱因。目前以原发病的对症治疗、呼吸支持为主,总体上缺乏特效的药物及治疗手段,治疗效果不太理想[1,32, 33]。因此,深入探究ALI发生的机制,寻找ALI预防措施及新型治疗药物具有重要意义。
巨噬细胞常通过吞噬作用释放活性氧以及产生炎症细胞因子来发挥免疫调节作用。ALI发生时,大量炎症细胞被募集,其中肺泡巨噬细胞首先被激活并产生大量的活性氧,最终造成细胞和组织损伤,甚至导致MODS。因此,抑制炎症反应及减轻细胞氧化应激损伤,是减轻脓毒症组织器官损伤的重要治疗策略[10,34, 35, 36, 37, 38]。本团队的前期研究及其他学者的研究均显示,ADSC外泌体可以调控巨噬细胞,减轻巨噬细胞引起的炎症反应进而发挥其保护作用[20,39, 40]。本研究显示,CLP+ADSC外泌体组较单纯CLP组小鼠肺水肿症状明显减轻,炎症细胞浸润明显减少,细胞凋亡、坏死情况明显改善,同时检测到炎症反应因子TNF-α、IL-1β的表达水平明显降低,氧化产物丙二醛含量明显降低,抗氧化物质SOD含量明显升高,这与前述研究结果类似。本研究还显示,CLP+ADSC外泌体组较单纯CLP组小鼠肺组织中CD86阳性细胞即M1型巨噬细胞占比减少、CD206阳性细胞即M2型巨噬细胞占比增多；ADSC外泌体可以下调LPS诱导的M1型巨噬细胞特异性标志物iNOS的mRNA表达,而上调M2型巨噬细胞特异性标志物Arg1的mRNA表达,这表明ADSC外泌体可以抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症反应,促进巨噬细胞向M2型极化,通过抑制巨噬细胞炎症反应进而改善脓毒症诱导的ALI。
线粒体是细胞内的主要产能结构,线粒体发生氧化磷酸化的过程不仅可以为细胞生长提供生物能量和生物中间体,还可以通过代谢-表观遗传调节决定细胞状态和功能[41, 42, 43]。在有害物质的刺激下,线粒体易发生肿胀、碎裂,基质密度降低和嵴的数量减少,最终引起线粒体功能障碍,表现为线粒体活性氧增加、ATP产生减少、DNA损伤以及由此产生的氧化应激引起细胞损伤[44, 45, 46, 47, 48]。线粒体功能障碍引起的氧化应激增强可促进大量活性氧生成,进而激活核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3等多种途径,促进M1型巨噬细胞的极化,导致一系列瀑布样炎症反应[49, 50, 51, 52]。研究显示,在ALI、ARDS等多种疾病的发病过程中,线粒体功能障碍参与了过度炎症反应和过度活性氧产生[9, 10,53]。本研究观察到单纯LPS组相较于空白对照组的RAW264.7细胞ATP含量降低,线粒体膜电位下降、线粒体活性氧生成增加。活性氧是细胞有氧代谢过程中产生的中间产物,可与不饱和脂肪酸形成脂质活性氧,从而破坏细胞内膜结构,造成细胞损伤。线粒体作为氧化磷酸化的关键场所,参与了活性氧的产生和代谢,线粒体不仅是活性氧的主要来源,也是活性氧作用的主要靶点。LPS在诱导炎症反应的同时可进一步促进活性氧生成,继而导致线粒体功能障碍及膜电位下降,最终导致线粒体功能紊乱[54, 55]。因此,恢复线粒体功能稳态对于维持巨噬细胞的正常状态和防止其对LPS刺激的过度反应至关重要。
总之,本研究显示人ADSC外泌体可被RAW264.7细胞内吞或吞噬,进而改善LPS诱导的巨噬细胞线粒体功能障碍,使细胞内线粒体活性氧水平显著降低,线粒体膜电位得到恢复,从而重新编程巨噬细胞的代谢状态,维持ATP供应,抑制巨噬细胞持续向M1型极化,减轻炎症反应,并表现出对脓毒症小鼠肺损伤的抑制作用。后期本团队将探究在脓毒症诱发的ALI过程中,人ADSC外泌体改善巨噬细胞线粒体功能障碍,促进组织损伤修复的确切作用机制等。
何佳、王婧薷：酝酿和设计实验、实验研究和论文撰写；甘文军、李桂强：数据整理、分析数据；信琪、林泽鹏、阮树斌：统计分析；陈晓东：研究指导、经费支持所有作者均声明不存在利益冲突 -
参考文献
(22) [1] RodriguesM,KosaricN,BonhamCA,et al.Wound healing: a cellular perspective[J].Physiol Rev,2019,99(1):665-706.DOI: 10.1152/physrev.00067.2017. [2] StegleO,TeichmannSA,MarioniJC.Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics[J].Nat Rev Genet,2015,16(3):133-145.DOI: 10.1038/nrg3833. [3] PatelS,SrivastavaS,SinghMR,et al.Mechanistic insight into diabetic wounds: pathogenesis, molecular targets and treatment strategies to pace wound healing[J].Biomed Pharmacother,2019,112:108615.DOI: 10.1016/j.biopha.2019.108615. [4] NielsenJS,McNagnyKM.Novel functions of the CD34 family[J].J Cell Sci,2008,121(Pt 22):3683-3692.DOI: 10.1242/jcs.037507. [5] Díaz-FloresL,GutiérrezR,GarcíaMP,et al.Cd34 + stromal cells/telocytes in normal and pathological skin[J].Int J Mol Sci,2021,22(14):7342.DOI: 10.3390/ijms22147342. [6] WangL,QinW,ZhouY,et al.Transforming growth factor β plays an important role in enhancing wound healing by topical application of Povidone-iodine[J].Sci Rep,2017,7(1):991.DOI: 10.1038/s41598-017-01116-5. [7] ZhuB,NahmiasY,YarmushML,et al.Microfluidic isolation of CD34-positive skin cells enables regeneration of hair and sebaceous glands in vivo[J].Stem Cells Transl Med,2014,3(11):1354-1362.DOI: 10.5966/sctm.2014-0098. [8] NuutilaK,SinghM,KruseC,et al.Wound healing from dermal grafts containing CD34 + cells is comparable to wound healing with split-thickness skin micrografts[J].Plast Reconstr Surg,2017,140(2):306-314.DOI: 10.1097/PRS.0000000000003516. [9] HeJ,HuangW,WangJ,et al.Single-cell analysis reveals distinct functional heterogeneity of CD34 + cells in anagen wound and diabetic wound[J].Biochem Biophys Res Commun,2023,639:9-19.DOI: 10.1016/j.bbrc.2022.11.080. [10] HanJ,LinK,ChooH,et al.β-catenin signaling evokes hair follicle senescence by accelerating the differentiation of hair follicle mesenchymal progenitors[J].Front Cell Dev Biol,2022,10:839519.DOI: 10.3389/fcell.2022.839519. [11] PennigJ,ScherrerP,GisslerMC,et al.Glucose lowering by SGLT2-inhibitor empagliflozin accelerates atherosclerosis regression in hyperglycemic STZ-diabetic mice[J].Sci Rep,2019,9(1):17937.DOI: 10.1038/s41598-019-54224-9. [12] LandénNX,LiD,StåhleM.Transition from inflammation to proliferation: a critical step during wound healing[J].Cell Mol Life Sci,2016,73(20):3861-3885.DOI: 10.1007/s00018-016-2268-0. [13] SunZ,SunX,YuanY,et al.FCGR2B as a prognostic and immune microenvironmental marker for gliomas based on transcriptomic analysis[J].Medicine (Baltimore),2023,102(37):e35084.DOI: 10.1097/MD.0000000000035084. [14] DevosH,ZoidakisJ,RoubelakisMG,et al.Reviewing the regulators of COL1A1[J].Int J Mol Sci,2023,24(12):10004.DOI: 10.3390/ijms241210004. [15] TaiY,WoodsEL,DallyJ,et al.Myofibroblasts: function, formation, and scope of molecular therapies for skin fibrosis[J].Biomolecules,2021,11(8):1095.DOI: 10.3390/biom11081095. [16] GanQ,YoshidaT,LiJ,et al.Smooth muscle cells and myofibroblasts use distinct transcriptional mechanisms for smooth muscle alpha-actin expression[J].Circ Res,2007,101(9):883-892.DOI: 10.1161/CIRCRESAHA.107.154831. [17] DanielJM,ProckA,DutzmannJ,et al.Regulator of G-protein signaling 5 prevents smooth muscle cell proliferation and attenuates neointima formation[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2016,36(2):317-327.DOI: 10.1161/ATVBAHA.115.305974. [18] ChenZ,ZhouL,LiuL,et al.Single-cell RNA sequencing highlights the role of inflammatory cancer-associated fibroblasts in bladder urothelial carcinoma[J].Nat Commun,2020,11(1):5077.DOI: 10.1038/s41467-020-18916-5. [19] SreedharA,Aguilera-AguirreL,SinghKK.Mitochondria in skin health, aging, and disease[J].Cell Death Dis,2020,11(6):444.DOI: 10.1038/s41419-020-2649-z. [20] AkermanSC,HossainS,ShoboA,et al.Neurodegenerative disease-related proteins within the epidermal layer of the human skin[J].J Alzheimers Dis,2019,69(2):463-478.DOI: 10.3233/JAD-181191. [21] NodaS,HosoyaT,KomiyaY,et al.CD34 +THY1 + synovial fibroblast subset in arthritic joints has high osteoblastic and chondrogenic potentials in vitro[J].Arthritis Res Ther,2022,24(1):45.DOI: 10.1186/s13075-022-02736-7. [22] DuZ,YouX,WuD,et al.Rhythm disturbance in osteoarthritis[J].Cell Commun Signal,2022,20(1):70.DOI: 10.1186/s12964-022-00891-7. -
1 2组全层皮肤缺损小鼠伤后各时间点创面形态及伤后4 d CD34 +细胞在创面中的定位。1A、1B.分别为对照组伤后0（即刻）、4 d创面形态，图1B中创面面积缩小，表皮再上皮化；1C、1D.分别为糖尿病组伤后0、4 d创面形态，图1D创面较图1B愈合延迟，仅有较薄的新生表皮；1E、1F.分别为CD34 +细胞在对照组、糖尿病组创面中的定位以及与角蛋白14共定位，CD34 +细胞位于创面周围组织的真皮、毛囊、血管周围和部分表皮细胞以及创面新生组织，在图1F创面周围组织的毛囊中减少 Alexa Fluor 647-4'，6-二脒基-2-苯基吲哚×20；1G、1H.分别为图1E、1F中方框中图形的放大图，可见CD34表达在创面新生表皮的部分细胞中 Alexa Fluor 647-4'，6-二脒基-2-苯基吲哚×60
注：对照组小鼠为CD34+细胞谱系追踪小鼠，糖尿病组小鼠为CD34+细胞谱系追踪糖尿病小鼠；CD34+细胞呈绿色，非CD34+细胞呈红色，角蛋白14呈白色，细胞核呈蓝色
2 2组全层皮肤缺损小鼠伤后4 d创面组织中CD34 +细胞亚群及其占比。2A、2B.分别为对照组、糖尿病组创面中CD34 +细胞亚群的二维流形近似和投影云图；2C.CD34 +细胞亚群占比
注：对照组小鼠为CD34+细胞谱系追踪小鼠，糖尿病组小鼠为CD34+细胞谱系追踪糖尿病小鼠
3 总体分析2组全层皮肤缺损小鼠伤后4 d创面组织中各CD34 +细胞亚群前10高表达标记基因及注释细胞亚群的标记基因。3A.热图展示各CD34 +细胞亚群前10高表达标记基因；3B.气泡图展示注释细胞亚群的标记基因
注：对照组小鼠为CD34+细胞谱系追踪小鼠，糖尿病组小鼠为CD34+细胞谱系追踪糖尿病小鼠；图3A从左至右各列依次分别为标记类软骨细胞的线粒体编码的细胞色素C氧化酶Ⅱ（MT-CO2）、MT-CO1、MT-CO3、线粒体细胞色素b、线粒体编码的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸：泛醌氧化还原酶核心亚基1（MT-ND1）、线粒体编码的ATP合酶膜亚基6、MT-ND4、MT-ND2、MT-ND3、转移相关肺腺癌转录本1（MALAT1），标记内皮细胞的脂肪酸结合蛋白4（FABP4）、选择素P、血小板和内皮细胞黏附分子1、水通道蛋白1、CD36分子、跨膜4 L六家族成员1、质膜小囊泡相关蛋白、清道夫受体B类成员1、含载脂蛋白L结构域1、富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1，标记成纤维细胞（Fb）亚群1的Gremlin 1（GREM1）、胰岛素样生长因子结合蛋白1、基质金属蛋白酶3（MMP3）、细胞视黄酸结合蛋白1、Fcγ受体Ⅱb、MMP11、凝血因子ⅩⅢ A链、ⅩⅩⅢ型胶原蛋白α1（COL23A1）、羧肽酶X-M14家族成员1、血清淀粉样蛋白A3，标记Fb亚群2的补体成分4B（C4B）、羧肽酶Z、COL1A2、COL1A1、AE结合蛋白1、转化生长因子β诱导蛋白、类纤维蛋白原样蛋白2、前胶原C-内肽酶增强子2、整合素亚基β样1、导向蛋白3B抗体，标记Fb亚群3的H19印记母源表达转录本（H19）、C-X-C趋化因子配体1（CXCL1）、CXCL5、正五聚蛋白3、分泌型卷曲相关蛋白2、微纤维相关蛋白5、白细胞介素（IL）1受体类似物2、蛋白聚糖4、血小板反应蛋白4和COL4A1，标记Fb亚群4的Dickkopf Wnt信号通路抑制剂2（DKK2）、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶2、凝血因子Ⅱ凝血酶受体、肽酶抑制剂16、细胞色素P450家族1亚家族B成员1、生长停滞特异性1、群体凝血因子C同源物、核受体亚家族4A组成员1、弹性蛋白、结缔组织生长因子，标记Fb亚群5的纤维调节蛋白（FMOD）、Wnt抑制因子1、腱调蛋白、胆囊收缩素、胶质蛋白、Ig超家族成员10（IGSF10）和IGSF5，标记角质形成细胞的角蛋白5、分层蛋白、角蛋白17、角蛋白15、角蛋白14、半乳糖凝集素7、与外周髓磷脂蛋白22相关的P53凋亡效应物质、胎盘表达转录本1、角蛋白6a和角质蛋白连接蛋白，标记巨噬细胞的CD74分子、组织相容性Ⅱ类抗原Aα、H2-Ab1、溶菌酶2、C-C型趋化因子配体3（CCL3）、S100钙结合蛋白A9、CCL4、CD14分子、丝氨酸和CXCL3，标记平滑肌细胞的G蛋白信号调节蛋白5（RGS5）、Notch受体3、肌球蛋白重链11、11号染色体开放阅读框96、内皮素受体B型、肌球蛋白轻链9、平滑肌肌动蛋白α-2、肌球蛋白轻链激酶、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白类似蛋白1、转胶蛋白，标记T细胞的可诱导T细胞共刺激分子（ICOS）、IL-17A、IL-17F、RGS1、IL-2受体亚单位β、溶酶体蛋白跨膜5、胚细胞抗原、环腺苷酸反应元件调制器、液泡蛋白分拣相关蛋白37B、RGS2；图3B横坐标下1为MALAT1，2为FABP4，3为GREM1，4为C4B，5为H19，6为DKK2，7为FMOD，8为角蛋白5，9为CD74分子，10为RGS5，11为ICOS；标记Fb亚群5的3个基因与其他细胞标记基因重叠
4 2组全层皮肤缺损小鼠伤后4 d创面组织间CD34 +成纤维细胞亚群1差异表达显著的DEG的GO和KEGG富集分析。4A.糖尿病组较对照组显著上调的DEG；4B.糖尿病组较对照组显著下调的DEG
注：对照组小鼠为CD34+细胞谱系追踪小鼠，糖尿病组小鼠为CD34+细胞谱系追踪糖尿病小鼠；KEGG为京都基因与基因组百科全书，GO为基因本体论，DEG为差异表达基因；图4A横坐标从左至右对应富集条目为破骨细胞分化、白细胞介素17（IL-17）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶信号通路、抗原处理和呈递、Janus激酶-信号转导及转录活化因子信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、核糖体、流体剪切应力与动脉粥样硬化、冠状病毒疾病-新型冠状病毒感染、蛋白质同源二聚活性、肽酶活性、金属内肽酶活性、相同蛋白质结合、蛋白酶结合、金属肽酶活性、肽酶抑制剂活性、核糖体的结构成分、受体结合、蛋白质结合、活化蛋白-1转录复合物、细胞外基质、核糖体、细胞表面、细胞核、核糖核蛋白复合体、细胞质、胞质核糖体、细胞外区、细胞外间隙、正调控血管生成、动物器官再生、肽酶活性的负调控、蛋白质加工、细胞对IL-1的反应、对肽酶激素的反应、细胞迁移的正向调节、对脂多糖的反应、细胞增殖的负调控、细胞翻译；图4B横坐标从左至右对应富集条目为阿米巴病、库欣综合征、EB病毒感染、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B信号通路、糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体信号通路、黏着斑、人乳头瘤病毒感染、癌症中的蛋白聚糖、细胞外基质受体相互作用、蛋白质的消化和吸收、肝素结合、蛋白酶结合、相同蛋白质结合、血小板衍生生长因子结合、整合素结合、钙离子结合、蛋白质结合、胶原结合、赋予拉伸强度的细胞外基质结构成分、细胞外基质结构成分、弹性纤维、内质网、细胞表面、肌膜、肌腱、基底膜、胶原三聚体、细胞外间隙、细胞外区、细胞外基质、炎症反应的负调控、成纤维细胞生长因子受体信号通路的负调控、细胞迁移、细胞对干扰素β的反应、胶原生物合成过程、细胞-基质黏附、创面修复、细胞黏附、胶原原纤维组装、细胞外基质组装
5 2组全层皮肤缺损小鼠伤后4 d创面组织间CD34 +成纤维细胞亚群2差异表达显著的DEG的GO和KEGG富集分析。5A.糖尿病组较对照组显著上调的DEG；5B.糖尿病组较对照组显著下调的DEG
注：对照组小鼠为CD34+细胞谱系追踪小鼠，糖尿病组小鼠为CD34+细胞谱系追踪糖尿病小鼠；KEGG为京都基因与基因组百科全书，GO为基因本体论，DEG为差异表达基因；图5A横坐标从左至右对应富集条目为癌症中的微小RNA、白细胞介素17信号通路、序列特异性双链DNA结合、肽酶活性、鸟苷三磷酸酶活性、金属肽酶活性、双链DNA结合、肝素结合、高密度脂蛋白颗粒、细胞外基质（ECM）、细胞外间隙、细胞外区、衰老、细胞对过氧化氢的反应、短期记忆、胶原原纤维组装、细胞增殖调控、细胞凋亡过程的正调控、正调控血管生成、对有机环状化合物的反应、对氧化应激的反应、细胞增殖的负调控；图5B横坐标从左至右对应富集条目为代谢途径、糖胺聚糖结合、肝素结合、钙离子结合、生长因子活性、胰岛素样生长因子结合、生长因子结合、ECM结构成分、基底膜、ECM、细胞外间隙、细胞外区、内皮细胞形态发生、细胞增殖的负调控、对维生素D的反应、钙离子转运的负调控、转化生长因子β产生的正调控、对糖皮质激素的反应、细胞对环腺苷酸的反应、细胞增殖的正向调节、ECM组装、衰老
6 较对照组显著上调的糖尿病组小鼠伤后4 d全层皮肤缺损创面组织中CD34 +平滑肌细胞差异表达基因的GO和KEGG富集分析
注：对照组小鼠为CD34+细胞谱系追踪小鼠，糖尿病组小鼠为CD34+细胞谱系追踪糖尿病小鼠；KEGG为京都基因与基因组百科全书，GO为基因本体论；横坐标从左至右对应富集条目为内吞作用、流体剪切应力与动脉粥样硬化、人巨噬细胞感染、癌症中的蛋白聚糖、癌症中的发病途径、吞噬体、整合素结合、蛋白激素结合、肽酶活性、相同蛋白质结合、泛素-蛋白质连接酶结合、金属离子结合、前mRNA内含子结合、酶结合、细胞外基质结合、蛋白质结合、线粒体、RNA聚合酶Ⅱ转录因子复合物、核基质、高尔基膜、核糖核蛋白复合体、内质网、核、细胞质、核质、细胞溶质、神经元凋亡过程的正调控、神经元投射发育的负调控、细胞质微管组织、镁离子传输、细胞外基质组装、信号肽处理、转录的正调控（DNA模板）、骨骼系统发育、凋亡过程、细胞迁移
7 2组全层皮肤缺损小鼠伤后4 d创面组织间CD34 +角质形成细胞差异表达显著的差异表达基因的GO和KEGG富集分析
注：对照组小鼠为CD34+细胞谱系追踪小鼠，糖尿病组小鼠为CD34+细胞谱系追踪糖尿病小鼠；KEGG为京都基因与基因组百科全书，GO为基因本体论；横坐标从左至右对应富集条目为非酒精性脂肪肝、糖尿病性心肌病、化学致癌-活性氧、氧化磷酸化、神经退行性变的途径、脊髓侧索硬化症、亨廷顿舞蹈症、阿尔兹海默病、帕金森病、朊病毒病、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（泛醌）活性、核苷酸活性、核酸结合、相同蛋白质结合、单链DNA结合、大分子复合物结合、酶结合、染色质结合、RNA结合、蛋白质结合、剪切体复合物、线粒体呼吸链复合体Ⅰ、呼吸链、核糖核蛋白复合体、细胞溶质、线粒体内膜、线粒体、细胞质、核质、细胞核、线粒体电子运输、DNA复制、核糖体RNA处理、信使RNA剪切（通过剪切体）、细胞周期、转录的正调控（DNA模板）、线粒体呼吸链复合体Ⅰ组装、有氧呼吸、RNA剪切、线粒体ATP合成偶联质子转运
8 2组全层皮肤缺损小鼠伤后4 d创面组织间CD34 +类软骨细胞差异表达显著的差异表达基因的GO和KEGG富集分析
注：对照组小鼠为CD34+细胞谱系追踪小鼠，糖尿病组小鼠为CD34+细胞谱系追踪糖尿病小鼠；KEGG为京都基因与基因组百科全书，GO为基因本体论；横坐标从左至右对应富集条目为阿米巴病、化学致癌-活性氧、糖尿病并发症中晚期糖基化终末产物（AGE）-AGE受体信号、内吞作用、流体剪切应力与动脉粥样硬化、抗原处理和呈递、糖尿病性心肌病、癌症中的蛋白聚糖、爱泼斯坦-巴尔病毒感染、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、染色体DNA结合、整合素结合、细胞外基质（ECM）结构成分、肽酶活性、相同蛋白质结合、酶结合、泛素蛋白连接酶结合、胶原结合、大分子复合物结合、蛋白质结合、核内小体、大分子化合物、核糖核蛋白复合体、细胞表面、细胞外区、早期内膜体、ECM、核质、细胞质、细胞核、自然杀伤细胞介导的细胞毒性的保护、对过氧化氢的反应、蛋白质磷酸化的正调控、细胞迁移的正向调控、基因表达的昼夜节律调节、染色质组装、昼夜节律的调控、内皮细胞迁移的正调控、转录的负调控（DNA模板）、节律过程
期刊类型引用(22)
1. 熊新娟，皮红英. 危重烧伤患者早期护理评估指标的构建及适用性分析. 中华急危重症护理杂志. 2025(02): 146-152 . 
百度学术2. 尹苹. 重症烧伤患者创伤应激与心理弹性变化的相关性及处理对策. 广州医药. 2024(01): 73-78 . 百度学术3. 李季，李春峰，任宛丽. FMEA指导下的五色分层风险识别在EICU重症肺炎中的应用. 海南医学. 2024(04): 580-585 . 百度学术4. 袁蓓，边东梅，闫沛，杜白茹. 术中体位护理联合手术室低体温防护对机器人辅助根治性膀胱切除原位回肠新膀胱术患者舒适度及术后并发症的效果比较. 机器人外科学杂志(中英文). 2024(02): 206-212 . 百度学术5. 姜晓燕. 以应激系统理论为指导的护理干预对重度烧伤患者创伤后应激障碍及生活质量的影响. 黑龙江医学. 2024(08): 992-995 . 百度学术6. 黄沛君，冯进进. FMEA模式下构建急诊危重症患者临床护理路径管理研究. 中国急救复苏与灾害医学杂志. 2024(05): 667-672 . 百度学术7. 陈卉，王伟芳，卢莉莉，王丽晖，藏雪莹，高来娣，朱文静，卢文欣. 正念行为训练联合早期康复锻炼对上肢重度烧伤后整形植皮患者伤残接受度的影响. 中国当代医药. 2024(16): 164-167 . 百度学术8. 李亚敏，李鹏程，阿古达木，郑曼妮，何彦琴，孙天骏. 烧伤后关节功能障碍的康复措施应用进展. 锦州医科大学学报. 2024(04): 110-113 . 百度学术9. 王婷，冯宪凌，崔婷. 基于FMEA模式的护理干预应用于宫颈癌患者PICC化疗过程中的效果. 中国药物滥用防治杂志. 2024(08): 1540-1543 . 百度学术10. 莫美兴，唐玮炜，陈惠敏，黄艳贞. 早期体位摆放联合康复功能锻炼对深度烧伤患者早期康复的影响. 名医. 2024(11): 27-29 . 百度学术11. 张方圆，王欢欢，张岐，王梦欣. 骨折合并特重度烧伤的护理风险评估与防范措施. 中国美容医学. 2024(12): 26-30 . 百度学术12. 张晓莉，何璐，吴燕，罗慧，林新秀. 基于FMEA模型的护理干预对垂体瘤患者手术相关指标及术中差错发生的影响. 齐齐哈尔医学院学报. 2023(05): 487-491 . 百度学术13. 范莹，张宏，郑巧，刘莉，卢吉，高杰. 失效模式-效应分析模型在妇科恶性肿瘤术后间歇性导尿中的应用. 当代护士(下旬刊). 2023(04): 113-116 . 百度学术14. 郑春东，黄秋环，黄芬，陆柳雪，王淑娴，黎青云，唐强，覃媚. 基于罗伊适应模式对老年烧伤患者护理的干预研究. 中国医药导报. 2023(19): 178-181 . 百度学术15. 吴玲玲，郑俊丽，叶利军. 失效模式与效应分析联合PDCA循环在ICU气管插管机械通气患者中的应用. 齐鲁护理杂志. 2023(16): 12-15 . 百度学术16. 钮敏红，陈群芳. 全程维温围术期护理在大面积烧伤切痂植皮术患者中的应用. 国际护理学杂志. 2023(23): 4326-4329 . 百度学术17. 凌梅. 儿童烧伤护理中舒适护理的应用价值. 妇儿健康导刊. 2023(05): 157-159 . 百度学术18. 郭琳，李玉娜，宋黎明. 失效模式和效应分析模式管理对产科住院患者的护理效果. 疾病监测与控制. 2023(06): 491-493+497 . 百度学术19. 胡丹，顾黎军，张雯雯，高燕飞. 营养路径管理模式在二、三度烧伤患者术后干预效果及对社会支持的影响研究. 手术电子杂志. 2023(06): 33-37 . 百度学术20. 叶衍，钱凤萍，邹丽芳. 失效模式下效应分析在急性心肌梗死急救护理风险流程管控中的效果. 心血管病防治知识. 2022(05): 46-49 . 百度学术21. 孙莉，李清华，姚丽凤. 同步激励理论结合精细面部护理在面部烧伤患者治疗中的应用效果及对其伤残接受度、歧视感及希望水平的影响. 中国美容医学. 2022(08): 175-178 . 百度学术22. 赵越，李金贵，张浩，修帆，杨胜利. 失效模式与效果分析法用于医院药事管理效果评价. 中国药业. 2022(17): 30-33 . 百度学术其他类型引用(1)
-
下载:
下载:
百度学术
计量
- 文章访问数: 8026
- HTML全文浏览量: 66
- PDF下载量: 54
- 被引次数: 23
