Two-sample Mendelian randomization analysis of the causal relationship between human immune cell phenotypes and keloids
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摘要:
目的 探讨人免疫细胞表型与瘢痕疙瘩之间的因果关系。 方法 该研究为基于双样本孟德尔随机化（MR）分析的研究。以人免疫细胞表型为暴露因素,以瘢痕疙瘩为结局,从全基因组关联分析数据库中获取免疫细胞表型（3 757个样本）与瘢痕疙瘩（668个样本）的数据。将与免疫细胞表型显著相关的单核苷酸多态性（SNP）作为工具变量并排除弱工具变量的影响,应用双样本MR分析评估731种人免疫细胞表型与瘢痕疙瘩之间的因果关系。采用逆方差加权（IVW）法推断因果关系,使用MR-Egger法、加权模式法和加权中位数法进行验证。针对符合假设的免疫细胞表型SNP,利用Cochran Q检验评估异质性,利用MR-Egger回归检验及MR-PRESSO离群值检验评估水平多效性。 结果 筛选出18 204个达到显著阈值（P<1×10-5）的SNP作为代表731种免疫细胞表型的工具变量,这些SNP均不是弱工具变量（F值均>10）。根据IVW法,确定了21种与瘢痕疙瘩存在潜在因果关系的免疫细胞表型,其中CD62L-单核细胞绝对计数、初始-成熟B细胞上的CD19表达、IgD+B细胞上的CD19表达、浆细胞前体（浆母细胞）上的CD27表达、CD62L+髓系树突状细胞上的CD86表达、自然杀伤T细胞上的CD45表达、CD39+CD4+调节性T细胞上的CD25表达、来源于单核髓系的抑制细胞上的CD45表达、效应记忆CD8+T细胞上的CD8表达、静息CD4+调节性T细胞上的CD45RA表达与瘢痕疙瘩均呈显著正相关（比值比分别为1.12、1.09、1.08、1.21、1.13、1.12、1.17、1.11、1.10、1.07,95%置信区间分别为1.03~1.23、1.02~1.16、1.01~1.15、1.06~1.38、1.02~1.25、1.01~1.24、1.03~1.33、1.00~1.23、1.00~1.20、1.01~1.13,P<0.05）,激活并分泌的CD4+调节性T细胞绝对计数、未转换记忆B细胞上的CD25表达、浆细胞样树突状细胞绝对计数、来源于单核髓系的抑制细胞上的CD14表达、自然杀伤T细胞上的CD8表达、IgD+CD38+B细胞上的CD20表达、CD11c+CD62L-单核细胞绝对计数、CD66b++髓系细胞绝对计数、粒细胞上的CD11c表达、CD14+CD16+单核细胞上的CD14表达、中心记忆CD8+T细胞上的CD3表达与瘢痕疙瘩均呈显著负相关（比值比分别为0.95、0.93、0.93、0.93、0.91、0.89、0.89、0.88、0.87、0.86、0.85,95%置信区间分别为0.90~1.00、0.87~0.99、0.88~0.99、0.87~0.99、0.84~1.00、0.81~0.98、0.81~0.98、0.79~0.99、0.78~0.96、0.75~0.99、0.74~0.96,P<0.05）。经MR-Egger法验证,CD39+CD4+调节性T细胞上的CD25表达、CD62L+髓系树突状细胞上的CD86表达、IgD+B细胞上的CD19表达、静息CD4+调节性T细胞上的CD45RA表达、中心记忆CD8+T细胞上的CD3表达与瘢痕疙瘩存在潜在因果关系（比值比分别为1.32、1.22、1.11、1.09、0.73,95%置信区间分别为1.03~1.70、1.04~1.44、1.02~1.21、1.01~1.19、0.55~0.95,P<0.05）；经加权中位数法验证,自然杀伤T细胞上的CD45表达、激活并分泌的CD4+调节性T细胞绝对计数、IgD+CD38+B细胞上的CD20表达、CD66b++髓系细胞绝对计数与瘢痕疙瘩存在潜在因果关系（比值比分别为1.15、0.93、0.87、0.83,95%置信区间分别为1.01~1.31、0.86~1.00、0.77~0.98、0.71~0.96,P<0.05）,其中IgD+CD38+B细胞上的CD20表达与瘢痕疙瘩的潜在因果关系另得到加权模式法的验证（比值比为0.86,95%置信区间为0.77~0.97,P<0.05）。根据前述IVW法分析结果,评估显示,与瘢痕疙瘩存在显著因果关系的21种免疫细胞表型的SNP均不存在显著异质性（P>0.05）或显著水平多效性（P>0.05）。 结论 从遗传学角度揭示了21种人免疫细胞表型和瘢痕疙瘩之间存在潜在因果关系,其中10种免疫细胞表型可能是瘢痕疙瘩的危险因素,11种免疫细胞表型可能是瘢痕疙瘩的保护因素。 Abstract:Objective To explore the causal relationship between human immune cell phenotypes and keloids. Methods This study was based on a two-sample Mendelian randomization (MR) analysis. Human immune cell phenotypes were considered as the exposure factors, and keloid was the outcome. Data on immune cell phenotypes (3 757 samples) and keloids (668 samples) were obtained from the genome-wide association study database. Using single nucleotide polymorphisms (SNPs) significantly associated with immune cell phenotypes as instrumental variables with the influence of weak instrumental variables being excluded, two-sample MR analysis was employed to evaluate the causal relationship between 731 human immune cell phenotypes and keloids. The inverse variance weighted (IVW) method was used to infer causal relationships, and the MR-Egger, weighted median, and weighted mode methods were used for validation. For SNPs of immune cell phenotypes meeting the hypothesis, the Cochran Q test was used to assess heterogeneity, and the MR-Egger regression and MR-PRESSO outlier tests were used to evaluate horizontal pleiotropy. Results A total of 18 204 SNPs meeting the significant threshold (P<1×10⁻⁵) were selected as instrumental variables for 731 immune cell phenotypes, and none of these SNPs were weak instrumental variables (with F values all >10). According to the IVW method, 21 immune cell phenotypes were identified with potential causal relationships to keloids, among which the CD62L- monocyte absolute count, CD19 on naive-mature B cell, CD19 on IgD+ B cell, CD27 on plasma blast-plasma cell, CD86 on CD62L+ myeloid dendritic cell, CD45 on natural killer T cell, CD25 on CD39+ CD4+ regulatory T cell, CD45 on monocytic myeloid-derived suppressor cells, CD8 on effector memory CD8+ T cell, and CD45RA on resting CD4+ regulatory T cell showed significant positive correlations with keloids (with odds ratios of 1.12, 1.09, 1.08, 1.21, 1.13, 1.12, 1.17, 1.11, 1.10, and 1.07, respectively, 95% confidence intervals of 1.03-1.23, 1.02-1.16, 1.01-1.15, 1.06-1.38, 1.02-1.25, 1.01-1.24, 1.03-1.33, 1.00-1.23, 1.00-1.20, and 1.01-1.13, respectively, P<0.05), while the activated and secreted CD4+ regulatory T cell absolute count, CD25 on unswitched memory B cell, plasmacytoid dendritic cell absolute count, CD14 on monocytic myeloid-derived suppressor cells, CD8 on natural killer T cell, CD20 on IgD+ CD38+ B cell, CD11c+ CD62L- monocyte absolute count, CD66b++ myeloid cell absolute count, CD11c on granulocytes, CD14 on CD14+ CD16+ monocyte, and CD3 on central memory CD8+ T cell showed significant negative correlations with keloids (with odds ratios of 0.95, 0.93, 0.93, 0.93, 0.91, 0.89, 0.89, 0.88, 0.87, 0.86, and 0.85, respectively, 95% confidence intervals of 0.90-1.00, 0.87-0.99, 0.88-0.99, 0.87-0.99, 0.84-1.00, 0.81-0.98, 0.81-0.98, 0.79-0.99, 0.78-0.96, 0.75-0.99, and 0.74-0.96, respectively, P<0.05). MR-Egger method confirmed the potential causal relationship existing respectively between CD25 on CD39+ CD4+ regulatory T cell, CD86 on CD62L+ myeloid dendritic cell, CD19 on IgD+ B cell, CD45RA on resting CD4+ regulatory T cell, CD3 on central memory CD8+ T cell and keloids (with odds ratios of 1.32, 1.22, 1.11, 1.09, and 0.73, respectively, 95% confidence intervals of 1.03-1.70, 1.04-1.44, 1.02-1.21, 1.01-1.19, and 0.55-0.95, respectively, P<0.05). The weighted median method confirmed the potential causal relationship existing respectively between CD45 on natural killer T cell, activated and secreted CD4+ regulatory T cells absolute count, CD20 on IgD+ CD38+ B cell, CD66b++ myeloid cell absolute count and keloids (with odds ratios of 1.15, 0.93, 0.87, and 0.83, respectively, 95% confidence intervals of 1.01-1.31, 0.86-1.00, 0.77-0.98, and 0.71-0.96, respectively, P<0.05). Among them, the potential causal relationship between CD20 on IgD+ CD38+ B cell and keloids was further verified by the weighted mode method (with odds ratio of 0.86, 95% confidence interval of 0.77-0.97, P<0.05). According to the aforementioned IVW method analysis results, the SNPs associated with the 21 immune cell phenotypes that had a significant causal relationship with keloids showed no significant heterogeneity (P>0.05) or significant horizontal pleiotropy (P>0.05). Conclusions From a genetic perspective, the potential causal relationships between 21 human immune cell phenotypes and keloids have been revealed, of which 10 immune cell phenotypes may be risk factors for keloids, while 11 immune cell phenotypes may act as protective factors for keloids. -
Key words:
- Keloid /
- Immunity, cellular /
- Mendelian randomization analysis /
- Immune system /
- Databases, genetic /
- Causality
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(1)从遗传学角度对人免疫细胞表型与瘢痕疙瘩之间的关系进行研究。
(2)揭示了瘢痕疙瘩中免疫微环境的复杂性和动态性。
(3)确认与瘢痕疙瘩存在因果关系的多种免疫细胞表型,为进一步探索这些免疫细胞表型在瘢痕疙瘩形成中的作用提供了靶点。
Highlights:
(1)The relationship between human immune cell phenotypes and keloids was investigated from a genetic perspective.
(2)The complexity and dynamic nature of the immune microenvironment in keloids was revealed.
(3)Multiple immune cell phenotypes with causal relationships to keloids were identified, providing targets for further exploration of their roles in keloid formation.
瘢痕疙瘩是一种病理性瘢痕,通常由感染、创伤、手术或某些不明原因引发,表现为机体对真皮层损伤的过度组织反应,其形成涉及Fb的异常增殖和胶原蛋白的过量产生,通常形成的瘢痕会超出原始损伤的范围,影响周围的正常皮肤[1]。瘢痕疙瘩在所有人群中都有发生,但在亚洲裔人群和非洲裔人群中较为常见,相较之下,在欧洲裔人群中的发生率较低[2]。瘢痕疙瘩不仅影响外表美观,且常伴有瘙痒、疼痛等症状,影响患者身心健康。瘢痕疙瘩发病机制复杂,仍未完全明确,导致临床治疗难度大,复发率高。因此需要深入了解瘢痕疙瘩的发病机制,以寻求更佳的治疗方案[3]。研究显示,瘢痕疙瘩的形成不仅涉及自身免疫反应和慢性炎症,还受到遗传和环境因素的影响[4, 5]。现有的遗传学研究已经发现了一些与瘢痕疙瘩发生显著相关的易感性基因位点[6]。此外,越来越多的证据表明免疫细胞浸润在瘢痕疙瘩的形成中具有关键作用[7, 8, 9],免疫细胞参与调节瘢痕疙瘩Fb的异常行为[10]。但是目前对于免疫细胞是否导致瘢痕疙瘩的形成及具体起作用的免疫细胞表型尚无完全一致的定论。
孟德尔随机化（Mendelian randomization,MR）分析是一种利用遗传变异即单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）作为工具变量分析暴露因素与疾病之间的潜在因果关系的流行病学方法。该方法基于孟德尔遗传定律,利用遗传变异随机分配和自由组合的特性,能够评估遗传变异与表型之间的因果关系,且不受混杂因素的影响[11]。本研究运用双样本MR（two-sample Mendelian randomization,TSMR）分析揭示不同类型的免疫细胞表型与瘢痕疙瘩之间的因果关系,探讨特定免疫细胞表型如何影响瘢痕疙瘩的发生发展,以期为今后瘢痕疙瘩的研究和临床治疗提供参考。
1. 资料与方法
1.1 研究设计
以人免疫细胞表型为暴露因素、瘢痕疙瘩为结局,根据下述标准从全基因组关联分析（genome-wide association study,GWAS）数据库（
https：//gwas.mrcieu.ac.uk/ ）中筛选SNP并将其作为工具变量[12],采用TSMR分析方法进行正向分析。正向TSMR分析因果推理中有效的工具变量必须同时满足3个关键假设[13]：（1）关联性,遗传变异与免疫细胞表型具有直接的关联（P<1×10-5）；（2）独立性,遗传变异与任何可能的混杂因素之间不存在关联；（3）限定准则,遗传变异对瘢痕疙瘩的影响仅通过免疫细胞表型途径。为避免反向因果关系,将暴露因素和结局互换,采用TSMR分析方法进行反向分析。人免疫细胞表型与瘢痕疙瘩的正反向TSMR分析核心假设及分析流程见图1。
图 1 人免疫细胞表型与瘢痕疙瘩的正反向双样本孟德尔随机化分析核心假设及分析流程图注：假设1为关联性假设,假设2为独立性假设,假设3为限定准则；图中“×”和虚线表示2个因子之间不产生作用,“✓”和实线表示2个因子之间可以产生作用；图中免疫细胞表型目前已知有731种1.2 数据来源
免疫细胞表型数据集（编号为GCST0001391~GCST0002121）源自一项发表于2020年的研究,内含731种免疫细胞表型数据[14]。原始免疫细胞表型的GWAS数据来源于3 757名欧洲撒丁岛人,调整性别、年龄等混杂因素后,测试了约2 200万个SNP[15]。731种免疫细胞表型又可以分为4种特征类型及7种细胞类型,其中4种特征类型包括了118个绝对细胞计数、389个中位荧光强度、32个形态参数和192个相对细胞计数,7种细胞类型包括经典树突状细胞、B细胞、单核细胞、成熟阶段T细胞、TBNK（包含T细胞、B细胞及自然杀伤细胞）、调节性T细胞（regulatory T cell,Treg）、髓样细胞。
瘢痕疙瘩数据集编号为GCST90018874,该数据来自一项发表于2021年的GWAS研究[16],研究对象包含481 912名欧洲人,其中瘢痕疙瘩患者668例、健康对照者481 244名,共分析了24 197 210个SNP。
1.3 工具变量的选择
从GWAS数据库中提取免疫细胞表型相关工具变量,通过关联性分析,挑选与免疫细胞表型强相关的SNP,筛选条件为P<1×10-5,并通过设置参数阈值：R2<0.1、碱基对数值<10 000进一步去除连锁不平衡的SNP。计算每个工具变量的F值,评估每个工具变量的强弱,其计算公式如下：F=（β/se）2,其中β是SNP对免疫细胞表型的影响大小,se是对应于β的标准误差[17]。移除F<10的弱工具变量,以避免弱工具变量对因果关联估计的影响[18]。
1.4 分析方法
1.4.1 免疫细胞表型与瘢痕疙瘩之间因果关系的正向TSMR分析
以逆方差加权（inverse variance weighted,IVW）法作为主要分析方法探讨731种免疫细胞表型与瘢痕疙瘩之间的因果关系。该方法通过综合各个工具变量的效应估计,并以其精确度的倒数作为权重来减少随机抽样误差。采用加权中位数法、MR-Egger法、加权模式法对IVW法的结果进行补充,若结果与IVW法保持一致则说明结果说服力更大,若结果与IVW法不一致则以IVW法结果为准。采用Benjamini-Hochberg法对IVW法的P值进行错误发现率（false discovery rate,FDR）校正,若PIVW<0.05且PFDR<0.05,则认为免疫细胞表型与瘢痕疙瘩之间存在显著因果关系；若PIVW<0.05而PFDR≥0.05,则认为免疫细胞表型与瘢痕疙瘩之间存在潜在因果关系；若PIVW≥0.05,则认为免疫细胞表型与瘢痕疙瘩之间不存在因果关系。对于TSMR分析结果,根据比值比判定免疫细胞表型与瘢痕疙瘩之间的关系：比值比>1,说明免疫细胞表型和瘢痕疙瘩之间呈正相关,即免疫细胞表型是瘢痕疙瘩的危险因素；比值比<1,说明免疫细胞表型和瘢痕疙瘩之间呈负相关,表示免疫细胞表型是瘢痕疙瘩的保护因素。
对IVW法分析结果中存在因果关系的数据,即符合假设的免疫细胞表型SNP进行敏感性分析。采用Cochran Q检验,评估工具变量效应的异质性,P>0.05说明工具变量效应一致,纳入的工具变量不存在异质性,研究结果不需要考虑异质性造成的影响。利用MR-Egger回归检验及MR-PRESSO离群值检验识别潜在的水平多效性对因果关系的影响,如果MR-Egger回归检验的P>0.05则认为不存在水平多效性,即SNP主要通过免疫细胞表型影响瘢痕疙瘩[19]；如果MR-PRESSO离群值检验中存在异常值,且将其剔除后重新进行TSMR分析,P>0.05表示不存在水平多效性。
1.4.2 反向TSMR分析
采用IVW法评估瘢痕疙瘩与前述正向TSMR分析得出的具有统计学意义的免疫细胞表型之间是否存在反向因果关系。
1.5 统计学处理
采用R 3.5.3软件及开源全基因组关联分析工具集PLINK进行数据分析,通过“Mendelian-Randomization”R 0.4.3程序包完成TSMR分析。效应值采用比值比和95%置信区间表示,P<0.05表示差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 工具变量
筛选出18 204个达到显著阈值（P<1×10-5）的SNP作为代表731种免疫细胞表型的工具变量,其F值范围为19.55~2 435.82,均>10,即SNP均不是弱工具变量。
2.2 正向TSMR分析
2.2.1 免疫细胞表型与瘢痕疙瘩之间的因果关系
采用PIVW<0.05且PFDR<0.05的标准,正向TSMR分析并未揭示出任何免疫细胞表型与瘢痕疙瘩之间存在显著因果关系。根据IVW（PIVW<0.05）法,确定了21种与瘢痕疙瘩存在潜在因果关系的免疫细胞表型,其中10种免疫细胞表型与瘢痕疙瘩均呈显著正相关（P<0.05）,11种免疫细胞表型与瘢痕疙瘩均呈显著负相关（P<0.05）。见表1。
Table 1. 逆方差加权法分析得出21种人免疫细胞表型与瘢痕疙瘩存在潜在因果关系免疫细胞表型 单核苷酸多态性数（个） 比值比 95%置信区间 P值 浆细胞前体（浆母细胞）上的CD27表达 19 1.21 1.06~1.38 0.006 CD39+CD4+调节性T细胞上的CD25表达 17 1.17 1.03~1.33 0.014 CD62L+髓系树突状细胞上的CD86表达 23 1.13 1.02~1.25 0.016 自然杀伤T细胞上的CD45表达 22 1.12 1.01~1.24 0.012 CD62L-单核细胞绝对计数 21 1.12 1.03~1.23 0.036 来源于单核髓系的抑制细胞上的CD45表达 17 1.11 1.00~1.23 0.047 效应记忆CD8+T细胞上的CD8表达 24 1.10 1.00~1.20 0.047 初始-成熟B细胞上的CD19表达 28 1.09 1.02~1.16 0.009 IgD+B细胞上的CD19表达 28 1.08 1.01~1.15 0.035 静息CD4+调节性T细胞上的CD45RA表达 29 1.07 1.01~1.13 0.023 激活并分泌的CD4+调节性T细胞绝对计数 23 0.95 0.90~1.00 0.036 未转换记忆B细胞上的CD25表达 24 0.93 0.87~0.99 0.029 浆细胞样树突状细胞绝对计数 30 0.93 0.88~0.99 0.021 来源于单核髓系的抑制细胞上的CD14表达 24 0.93 0.87~0.99 0.026 自然杀伤T细胞上的CD8表达 19 0.91 0.84~1.00 0.048 IgD+CD38+B细胞上的CD20表达 26 0.89 0.81~0.98 0.017 CD11c+CD62L-单核细胞绝对计数 25 0.89 0.81~0.98 0.016 CD66b++髓系细胞绝对计数 16 0.88 0.79~0.99 0.026 粒细胞上的CD11c表达 25 0.87 0.78~0.96 0.006 CD14+CD16+单核细胞上的CD14表达 17 0.86 0.75~0.99 0.036 中心记忆CD8+T细胞上的CD3表达 18 0.85 0.74~0.96 0.013 经MR-Egger法、加权中位数法、加权模式法验证,上述21种免疫细胞表型中共有9种免疫细胞表型与瘢痕疙瘩存在潜在因果关系（P值均<0.05）,见表2,即仍需以IVW法结果为准。
Table 2. 补充双样本MR分析方法得出9种人免疫细胞表型与瘢痕疙瘩存在潜在因果关系分析方法与免疫细胞表型 单核苷酸多态性数（个） 比值比 95%置信区间 P值 MR-Egger法 CD39+CD4+调节性T细胞上的CD25表达 17 1.32 1.03~1.70 0.043 CD62L+髓系树突状细胞上的CD86表达 23 1.22 1.04~1.44 0.022 IgD+B细胞上的CD19表达 28 1.11 1.02~1.21 0.020 静息CD4+调节性T细胞上的CD45RA表达 29 1.09 1.01~1.19 0.041 中心记忆CD8+T细胞上的CD3表达 18 0.73 0.55~0.95 0.035 加权中位数法 自然杀伤T细胞上的CD45表达 22 1.15 1.01~1.31 0.030 激活并分泌的CD4+调节性T细胞绝对计数 23 0.93 0.86~1.00 0.039 IgD+CD38+B细胞上的CD20表达 26 0.87 0.77~0.98 0.026 CD66b++髓系细胞绝对计数 16 0.83 0.71~0.96 0.014 加权模式法 IgD+CD38+B细胞上的CD20表达 26 0.86 0.77~0.97 0.016 注：MR为孟德尔随机化 2.2.2 敏感性分析
根据前述IVW法分析结果,Cochran Q检验评估显示,与瘢痕疙瘩存在显著因果关系的21种免疫细胞表型的SNP均不存在显著异质性（P>0.05）；MR-Egger回归检验和MR-PRESSO离群值检验评估显示,与瘢痕疙瘩存在显著因果关系的21种免疫细胞表型的SNP均不存在显著水平多效性（P>0.05）。见表3。
Table 3. 与瘢痕疙瘩存在显著因果关系的21种人免疫细胞表型SNP的异质性与水平多效性分析结果免疫细胞表型 SNP数（个） Cochran Q检验 MR-Egger回归检验 MR-PRESSO离群值检验 Q值 P值 截距 P值 RSSobs P值 浆细胞前体（浆母细胞）上的CD27表达 19 10.24 0.924 0.019 0.424 11.66 0.927 CD39+CD4+调节性T细胞上的CD25表达 17 8.00 0.949 -0.031 0.285 9.30 0.946 CD62L+髓系树突状细胞上的CD86表达 23 21.73 0.476 -0.025 0.225 23.27 0.522 自然杀伤T细胞上的CD45表达 22 21.63 0.421 0.004 0.884 24.93 0.409 CD62L-单核细胞绝对计数 21 13.33 0.863 -0.011 0.565 14.25 0.887 来源于单核髓系的抑制细胞上的CD45表达 17 8.22 0.942 -0.006 0.858 9.05 0.943 效应记忆CD8+T细胞上的CD8表达 24 19.71 0.659 -0.022 0.316 20.81 0.696 初始-成熟B细胞上的CD19表达 28 29.50 0.337 0.005 0.797 32.20 0.356 IgD+B细胞上的CD19表达 28 25.83 0.528 -0.020 0.200 28.83 0.507 静息CD4+调节性T细胞上的CD45RA表达 29 21.40 0.808 -0.019 0.434 22.51 0.841 激活并分泌的CD4+调节性T细胞绝对计数 23 22.13 0.452 0.016 0.519 23.82 0.516 未转换记忆B细胞上的CD25表达 24 17.97 0.759 -0.015 0.333 19.20 0.790 浆细胞样树突状细胞绝对计数 30 36.26 0.166 0.001 0.955 38.83 0.217 来源于单核髓系的抑制细胞上的CD14表达 24 20.94 0.585 -0.016 0.492 21.99 0.648 自然杀伤T细胞上的CD8表达 19 19.02 0.390 -0.026 0.206 21.72 0.428 IgD+CD38+B细胞上的CD20表达 26 32.18 0.153 0.012 0.561 33.65 0.194 CD11c+CD62L-单核细胞绝对计数 25 14.78 0.927 -0.008 0.679 15.65 0.938 CD66b++髓系细胞绝对计数 16 10.26 0.803 -0.003 0.927 11.87 0.806 粒细胞上的CD11c表达 25 17.64 0.820 -0.016 0.481 18.73 0.843 CD14+CD16+单核细胞上的CD14表达 17 16.03 0.451 0.007 0.870 18.26 0.461 中心记忆CD8+T细胞上的CD3表达 18 15.39 0.568 0.036 0.231 16.99 0.620 注：SNP为单核苷酸多态性,MR为孟德尔随机化；Cochran Q检验评估异质性,另2种检验评估水平多效性 2.3 反向TSMR分析
反向TSMR分析显示,瘢痕疙瘩与21种免疫细胞表型之间均不存在因果关系（P>0.05）。见表4。
Table 4. 瘢痕疙瘩与21种人免疫细胞表型之间因果关系的逆方差加权法分析结果免疫细胞表型 单核苷酸多态性数（个） 比值比 95%置信区间 P值 CD62L-单核细胞绝对计数 10 0.99 0.93~1.06 0.821 CD11c+CD62L-单核细胞绝对计数 10 0.98 0.91~1.05 0.495 浆细胞样树突状细胞绝对计数 20 0.99 0.95~1.04 0.789 激活并分泌的CD4+调节性T细胞绝对计数 16 1.01 0.96~1.05 0.778 CD66b++髓系细胞绝对计数 9 1.00 0.90~1.10 0.956 初始-成熟B细胞上的CD19表达 12 1.01 0.96~1.07 0.608 IgD+B细胞上的CD19表达 12 1.01 0.96~1.06 0.675 IgD+CD38+B细胞上的CD20表达 15 1.00 0.96~1.04 0.998 未转换记忆B细胞上的CD25表达 11 0.99 0.93~1.06 0.808 浆细胞前体（浆母细胞）上的CD27表达 13 1.00 0.95~1.04 0.910 中心记忆CD8+T细胞上的CD3表达 15 0.99 0.94~1.05 0.809 CD62L+髓系树突状细胞上的CD86表达 14 1.02 0.95~1.09 0.559 自然杀伤T细胞上的CD45表达 10 1.00 0.95~1.05 0.993 CD39+CD4+调节性T细胞上的CD25表达 12 1.00 0.94~1.06 0.918 CD14+CD16+单核细胞上的CD14表达 8 1.01 0.94~1.08 0.749 来源于单核髓系的抑制细胞上的CD14表达 8 1.01 0.92~1.10 0.891 来源于单核髓系的抑制细胞上的CD45表达 5 1.00 0.80~1.26 0.986 效应记忆CD8+T细胞上的CD8表达 13 1.00 0.94~1.07 0.965 自然杀伤T细胞上的CD8表达 10 1.01 0.92~1.10 0.871 粒细胞上的CD11c表达 7 0.99 0.93~1.06 0.785 静息CD4+调节性T细胞上的CD45RA表达 13 0.99 0.92~1.06 0.781 3. 讨论
皮肤瘢痕是一种纤维增生性疾病,其特征是形态外观异常和功能改变[20]。增生性瘢痕和瘢痕疙瘩是需要积极干预的病理性瘢痕类型,了解其形成的基本机制对于制订有效的抑制异常瘢痕形成的策略至关重要。探究免疫细胞表型与瘢痕疙瘩之间的因果关系,对于瘢痕疙瘩的早期防治和开发干预性药物具有重要意义。本研究采用TSMR分析方法,探索免疫细胞表型与瘢痕疙瘩之间的关系。根据PIVW<0.05且PFDR<0.05的标准,并未揭示出任何免疫细胞表型与瘢痕疙瘩之间存在显著因果关系。然而,采用主要分析方法IVW（PIVW<0.05）法,本研究识别出21种免疫细胞表型与瘢痕疙瘩存在潜在因果关系,提示它们可能与瘢痕疙瘩形成有关。敏感性分析结果表明这些因果关系稳健,研究结果可信。此外,IVW的结果多被认为是因果效应评估的金标准[21],本课题组认为对于包含IVW法在内有2种及以上TSMR分析方法得出具有统计学意义的9种免疫细胞表型更值得进一步探讨。
越来越多的证据表明免疫细胞在瘢痕疙瘩中失调；与正常皮肤相比,多种T细胞、B细胞和肥大细胞渗入了瘢痕疙瘩病变部位[8]。普遍认为,Treg具有维持免疫耐受性和抑制免疫反应的作用[22]。有研究表明,将人瘢痕疙瘩Fb与从瘢痕疙瘩患者外周血中分离的以Treg为主的CD4+T细胞群共同培养,能够抑制瘢痕疙瘩Fb合成胶原[23]。然而,Treg分泌的TGF-β1具有抗炎和强烈促纤维化的双重作用[24]。另一项研究表明,人瘢痕疙瘩组织中的Treg数量及其相关的2种细胞因子IL-10和TGF-β1的转录水平显著升高,将瘢痕疙瘩Fb与纯化的Treg共培养会促进前者合成胶原[25]。因此,Treg在瘢痕疙瘩形成中的作用,可能受到其他免疫细胞和所处微环境的影响。现有的研究表明,Treg失调与瘢痕疙瘩的形成有关,但是关于Treg失调是否引发了胶原过度表达,以及胶原过度表达、瘢痕疙瘩中的促炎环境及巨噬细胞数量的增加是否共同诱发了Treg失调尚不清楚。本研究中,激活并分泌的CD4+Treg绝对计数是瘢痕疙瘩的保护因素,这与普遍认为的Treg免疫抑制作用相符。此外,静息CD4+Treg上的CD45RA表达是瘢痕疙瘩的危险因素,CD45RA通常在未激活或未经历过抗原刺激的免疫细胞上表达,通常与“静息”或“未成熟”细胞相关联[26],活化的Treg不表达CD45RA[27]。在瘢痕疙瘩病理状态下,未激活的Treg可能无法有效地调节免疫反应和控制炎症。有趣的是,本研究中CD39+CD4+Treg上的CD25表达是瘢痕疙瘩的危险因素,但是到目前为止未见关于这种免疫细胞表型与瘢痕疙瘩关系的研究。CD25是IL-2受体α链的标志物,广泛表达于多种免疫细胞中,尤其是在Treg中高表达[28]。IL-2是Treg分化、存活和发挥免疫抑制功能的关键细胞因子[29]。CD25的高表达使Treg能够高效利用IL-2,这对于Treg生存和维持免疫耐受功能至关重要[30]。Treg在过度活化的情况下,是否会在瘢痕疙瘩形成中具有促进作用仍需进一步探讨。本研究中,中心记忆CD8+T细胞上的CD3表达是瘢痕疙瘩的保护因素。CD3充当T细胞受体α-β链的辅助受体,允许特异性抗原结合,对T细胞活化至关重要。一项研究显示,瘢痕疙瘩患者CD8+T细胞数量多于健康人；瘢痕疙瘩患者组织中Fb与从瘢痕疙瘩患者外周血中分离出的CD8+T细胞共培养后,Fb数量显著减少、活力显著下降[31]。另一项研究通过流式细胞术分析了人瘢痕疙瘩组织中细胞的亚群和功能,结果显示瘢痕疙瘩组织中效应记忆CD8+T细胞和CD103+CD8+驻留记忆T细胞的数量增加[32]。因此CD8+T细胞的异常激活可能是瘢痕疙瘩的重要致病机制。本研究结果还显示,自然杀伤T细胞上的CD45表达是瘢痕疙瘩的危险因素。既往研究表明,小鼠自然杀伤T细胞参与小鼠皮肤创面修复,它们的存在会减慢创面闭合的速度,自然杀伤T细胞在早期创面中对炎症和纤维增生信号均起到负调控作用[33]。但目前尚未有关于自然杀伤T细胞与瘢痕疙瘩关系的研究。因此,有必要进一步探讨自然杀伤T细胞在瘢痕疙瘩形成中的潜在角色,以阐明其在瘢痕疙瘩形成中可能发挥的作用。
本研究结果显示,B细胞相关的表型IgD+B细胞上的CD19表达是瘢痕疙瘩的危险因素,IgD+CD38+B细胞上的CD20表达是瘢痕疙瘩的保护因素。目前B细胞在瘢痕疙瘩中的作用很少受到关注,但已有的研究表明B细胞可以参与皮肤真皮Fb的激活和胶原蛋白的沉积。局部应用小鼠纯化的成熟幼稚B细胞（表达B220/CD19/IgM/IgD）,能显著改善小鼠急性创面和糖尿病创面的愈合过程,揭示了B细胞在调节创面愈合中的潜力,特别是在瘢痕控制和炎症调节方面[34]。最近的研究还显示,人瘢痕疙瘩组织中CD20+B细胞和CD19+B细胞的百分比显著高于正常皮肤[35]。该研究表明瘢痕疙瘩表皮中,CD20+B细胞的比例明显低于正常皮肤。在瘢痕疙瘩的真皮层,CD20+B细胞和CD19+B细胞的比例相同；而在正常皮肤中,CD19+B细胞的比例高于CD20+B细胞。此外,CD19+CD20+B细胞在瘢痕疙瘩真皮中的百分比远多于正常皮肤[35]。以上这些文献在一定程度上支持了本研究结果,强调了B细胞在瘢痕疙瘩形成中的多面角色和重要性,为研究瘢痕疙瘩的形成提供了新的视角,但未来的研究应进一步探讨B细胞在瘢痕疙瘩形成中的具体作用机制。
本研究结果显示,CD62L+髓系树突状细胞上的CD86表达是瘢痕疙瘩的危险因素。树突状细胞包括朗格汉斯细胞、单核细胞衍生的树突状细胞、血浆树突状细胞和髓系树突状细胞,其中髓系树突状细胞具有免疫刺激作用[36]。有研究表明树突状细胞参与瘢痕疙瘩形成,在人瘢痕疙瘩组织中观察到树突状细胞浸润增加[37]。另有研究表明,在人瘢痕疙瘩真皮中,凝血因子ⅩⅢa亚基阳性树突状细胞的数量明显多于相应的增生性或成熟瘢痕区域,凝血因子ⅩⅢa亚基阳性树突状细胞在瘢痕疙瘩的形成中起促进作用[10,36]。CD66b被视为中性粒细胞标志物,本研究结果显示CD66b++髓系细胞绝对计数是瘢痕疙瘩的保护因素。有研究表明,小鼠的中性粒细胞通过微小RNA-233促进小鼠肝炎和纤维化的自发消退[38]。还有研究表明,小鼠中性粒细胞通过产生基质金属蛋白酶促进纤维溶解来抑制小鼠慢性肝损伤的纤维化,显示出对肝纤维化的保护作用[39]。另一项研究表明,人中性粒细胞通过释放中性粒细胞胞外诱捕网激活Fb上的Toll样受体9,并通过Toll样受体9/核因子κB/IL-6通路介导瘢痕增生。该研究还通过小鼠模型证实,减少中性粒细胞胞外诱捕网形成可以抑制Fb向肌Fb的分化[40]。既往对中性粒细胞的研究主要集中在创面愈合的早期阶段,然而中性粒细胞在瘢痕疙瘩形成中的作用仍不清楚,中性粒细胞参与创面愈合过程并可能具有双重作用,既可能通过促进炎症反应加重瘢痕,也可能通过抑制纤维化发挥保护作用。关于中性粒细胞在瘢痕疙瘩中的作用也需要进一步研究。
总体而言,本研究揭示了多种免疫细胞表型与瘢痕疙瘩存在潜在因果关系。本研究结果涉及多种细胞类型及免疫状态,强调了瘢痕疙瘩中免疫微环境的复杂性和动态性,对于阐明瘢痕疙瘩的形成机制有重要意义,为未来研究和治疗瘢痕疙瘩提供了新的方向。然而,本研究的局限性在于样本主要来自欧洲血统,限制了结果的普遍适用性,并且由于有关特定免疫细胞表型在瘢痕疙瘩中作用的研究较少,相关数据匮乏,本研究的结果尚需在动物模型或临床研究中进一步验证。未来研究应拓宽样本多样性并深入探索免疫细胞表型与瘢痕疙瘩风险的关系,以促进对瘢痕疙瘩形成机制的理解,并开发新的预防和治疗策略。
甘文军：设计并实施研究,检索和分析数据,论文撰写；王婧薷、何佳：检索及统计分析：陈晓东：设计实验,论文评阅和资金支持所有作者声明不存在利益冲突 -
参考文献
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图 1 人免疫细胞表型与瘢痕疙瘩的正反向双样本孟德尔随机化分析核心假设及分析流程图
注：假设1为关联性假设,假设2为独立性假设,假设3为限定准则；图中“×”和虚线表示2个因子之间不产生作用,“✓”和实线表示2个因子之间可以产生作用；图中免疫细胞表型目前已知有731种
Table 1. 逆方差加权法分析得出21种人免疫细胞表型与瘢痕疙瘩存在潜在因果关系
免疫细胞表型 单核苷酸多态性数（个） 比值比 95%置信区间 P值 浆细胞前体（浆母细胞）上的CD27表达 19 1.21 1.06~1.38 0.006 CD39+CD4+调节性T细胞上的CD25表达 17 1.17 1.03~1.33 0.014 CD62L+髓系树突状细胞上的CD86表达 23 1.13 1.02~1.25 0.016 自然杀伤T细胞上的CD45表达 22 1.12 1.01~1.24 0.012 CD62L-单核细胞绝对计数 21 1.12 1.03~1.23 0.036 来源于单核髓系的抑制细胞上的CD45表达 17 1.11 1.00~1.23 0.047 效应记忆CD8+T细胞上的CD8表达 24 1.10 1.00~1.20 0.047 初始-成熟B细胞上的CD19表达 28 1.09 1.02~1.16 0.009 IgD+B细胞上的CD19表达 28 1.08 1.01~1.15 0.035 静息CD4+调节性T细胞上的CD45RA表达 29 1.07 1.01~1.13 0.023 激活并分泌的CD4+调节性T细胞绝对计数 23 0.95 0.90~1.00 0.036 未转换记忆B细胞上的CD25表达 24 0.93 0.87~0.99 0.029 浆细胞样树突状细胞绝对计数 30 0.93 0.88~0.99 0.021 来源于单核髓系的抑制细胞上的CD14表达 24 0.93 0.87~0.99 0.026 自然杀伤T细胞上的CD8表达 19 0.91 0.84~1.00 0.048 IgD+CD38+B细胞上的CD20表达 26 0.89 0.81~0.98 0.017 CD11c+CD62L-单核细胞绝对计数 25 0.89 0.81~0.98 0.016 CD66b++髓系细胞绝对计数 16 0.88 0.79~0.99 0.026 粒细胞上的CD11c表达 25 0.87 0.78~0.96 0.006 CD14+CD16+单核细胞上的CD14表达 17 0.86 0.75~0.99 0.036 中心记忆CD8+T细胞上的CD3表达 18 0.85 0.74~0.96 0.013 
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Table 2. 补充双样本MR分析方法得出9种人免疫细胞表型与瘢痕疙瘩存在潜在因果关系
分析方法与免疫细胞表型 单核苷酸多态性数（个） 比值比 95%置信区间 P值 MR-Egger法 CD39+CD4+调节性T细胞上的CD25表达 17 1.32 1.03~1.70 0.043 CD62L+髓系树突状细胞上的CD86表达 23 1.22 1.04~1.44 0.022 IgD+B细胞上的CD19表达 28 1.11 1.02~1.21 0.020 静息CD4+调节性T细胞上的CD45RA表达 29 1.09 1.01~1.19 0.041 中心记忆CD8+T细胞上的CD3表达 18 0.73 0.55~0.95 0.035 加权中位数法 自然杀伤T细胞上的CD45表达 22 1.15 1.01~1.31 0.030 激活并分泌的CD4+调节性T细胞绝对计数 23 0.93 0.86~1.00 0.039 IgD+CD38+B细胞上的CD20表达 26 0.87 0.77~0.98 0.026 CD66b++髓系细胞绝对计数 16 0.83 0.71~0.96 0.014 加权模式法 IgD+CD38+B细胞上的CD20表达 26 0.86 0.77~0.97 0.016 注：MR为孟德尔随机化
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Table 3. 与瘢痕疙瘩存在显著因果关系的21种人免疫细胞表型SNP的异质性与水平多效性分析结果
免疫细胞表型 SNP数（个） Cochran Q检验 MR-Egger回归检验 MR-PRESSO离群值检验 Q值 P值 截距 P值 RSSobs P值 浆细胞前体（浆母细胞）上的CD27表达 19 10.24 0.924 0.019 0.424 11.66 0.927 CD39+CD4+调节性T细胞上的CD25表达 17 8.00 0.949 -0.031 0.285 9.30 0.946 CD62L+髓系树突状细胞上的CD86表达 23 21.73 0.476 -0.025 0.225 23.27 0.522 自然杀伤T细胞上的CD45表达 22 21.63 0.421 0.004 0.884 24.93 0.409 CD62L-单核细胞绝对计数 21 13.33 0.863 -0.011 0.565 14.25 0.887 来源于单核髓系的抑制细胞上的CD45表达 17 8.22 0.942 -0.006 0.858 9.05 0.943 效应记忆CD8+T细胞上的CD8表达 24 19.71 0.659 -0.022 0.316 20.81 0.696 初始-成熟B细胞上的CD19表达 28 29.50 0.337 0.005 0.797 32.20 0.356 IgD+B细胞上的CD19表达 28 25.83 0.528 -0.020 0.200 28.83 0.507 静息CD4+调节性T细胞上的CD45RA表达 29 21.40 0.808 -0.019 0.434 22.51 0.841 激活并分泌的CD4+调节性T细胞绝对计数 23 22.13 0.452 0.016 0.519 23.82 0.516 未转换记忆B细胞上的CD25表达 24 17.97 0.759 -0.015 0.333 19.20 0.790 浆细胞样树突状细胞绝对计数 30 36.26 0.166 0.001 0.955 38.83 0.217 来源于单核髓系的抑制细胞上的CD14表达 24 20.94 0.585 -0.016 0.492 21.99 0.648 自然杀伤T细胞上的CD8表达 19 19.02 0.390 -0.026 0.206 21.72 0.428 IgD+CD38+B细胞上的CD20表达 26 32.18 0.153 0.012 0.561 33.65 0.194 CD11c+CD62L-单核细胞绝对计数 25 14.78 0.927 -0.008 0.679 15.65 0.938 CD66b++髓系细胞绝对计数 16 10.26 0.803 -0.003 0.927 11.87 0.806 粒细胞上的CD11c表达 25 17.64 0.820 -0.016 0.481 18.73 0.843 CD14+CD16+单核细胞上的CD14表达 17 16.03 0.451 0.007 0.870 18.26 0.461 中心记忆CD8+T细胞上的CD3表达 18 15.39 0.568 0.036 0.231 16.99 0.620 注：SNP为单核苷酸多态性,MR为孟德尔随机化；Cochran Q检验评估异质性,另2种检验评估水平多效性
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Table 4. 瘢痕疙瘩与21种人免疫细胞表型之间因果关系的逆方差加权法分析结果
免疫细胞表型 单核苷酸多态性数（个） 比值比 95%置信区间 P值 CD62L-单核细胞绝对计数 10 0.99 0.93~1.06 0.821 CD11c+CD62L-单核细胞绝对计数 10 0.98 0.91~1.05 0.495 浆细胞样树突状细胞绝对计数 20 0.99 0.95~1.04 0.789 激活并分泌的CD4+调节性T细胞绝对计数 16 1.01 0.96~1.05 0.778 CD66b++髓系细胞绝对计数 9 1.00 0.90~1.10 0.956 初始-成熟B细胞上的CD19表达 12 1.01 0.96~1.07 0.608 IgD+B细胞上的CD19表达 12 1.01 0.96~1.06 0.675 IgD+CD38+B细胞上的CD20表达 15 1.00 0.96~1.04 0.998 未转换记忆B细胞上的CD25表达 11 0.99 0.93~1.06 0.808 浆细胞前体（浆母细胞）上的CD27表达 13 1.00 0.95~1.04 0.910 中心记忆CD8+T细胞上的CD3表达 15 0.99 0.94~1.05 0.809 CD62L+髓系树突状细胞上的CD86表达 14 1.02 0.95~1.09 0.559 自然杀伤T细胞上的CD45表达 10 1.00 0.95~1.05 0.993 CD39+CD4+调节性T细胞上的CD25表达 12 1.00 0.94~1.06 0.918 CD14+CD16+单核细胞上的CD14表达 8 1.01 0.94~1.08 0.749 来源于单核髓系的抑制细胞上的CD14表达 8 1.01 0.92~1.10 0.891 来源于单核髓系的抑制细胞上的CD45表达 5 1.00 0.80~1.26 0.986 效应记忆CD8+T细胞上的CD8表达 13 1.00 0.94~1.07 0.965 自然杀伤T细胞上的CD8表达 10 1.01 0.92~1.10 0.871 粒细胞上的CD11c表达 7 0.99 0.93~1.06 0.785 静息CD4+调节性T细胞上的CD45RA表达 13 0.99 0.92~1.06 0.781
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