Influence and its mechanism of allogeneic dermal papilla cells on the wound healing of full-thickness skin defects in mice
-
摘要:
目的 探索异体毛乳头细胞（DPC）对小鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响及其机制。 方法 该研究为实验研究。利用显微解剖结合胶原酶消化法自5只6周龄雄性C57BL/6J小鼠触须毛囊中提取DPC并成功鉴定。将18只8周龄雄性C57BL/6J小鼠按照随机数字表法分为磷酸盐缓冲液（PBS）组及DPC组（每组9只小鼠）,在所有小鼠背部创建全层皮肤缺损创面模型。分别于伤后2、4、6 d,通过创面周围皮下注射给予DPC组小鼠含1×106个第4代DPC的细胞悬液100 μL、PBS组小鼠等体积的PBS。伤后3、7、10、14 d,观察2组小鼠创面愈合情况及毛发生长情况并测量创面剩余面积；另测量2组小鼠伤后14 d创面毛发覆盖面积。伤后14 d,收集2组小鼠创面组织标本,行苏木精-伊红染色观察新生毛囊情况并计数,行Masson染色观察真皮层胶原沉积情况并测量胶原沉积面积,采用免疫荧光法检测Wnt/β连环蛋白信号通路相关分子β连环蛋白、淋巴增强结合因子1（Lef1）的蛋白表达,分别采用蛋白质印迹法和实时荧光定量反转录PCR法检测β连环蛋白、Lef1的蛋白和mRNA表达。各实验样本数均为3。 结果 与PBS组相比,DPC组小鼠伤后各时间点创面再上皮化速度加快,且在伤后10、14 d可见更多毛发生长。伤后7、10、14 d,DPC组小鼠创面剩余面积分别为（13.92±2.90）、（3.69±1.78）、（1.09±0.14）mm2,分别明显小于PBS组的（26.19±2.06）、（10.84±3.59）、（6.75±2.11）mm2（t值分别为5.85、3.09、4.63,P值均<0.05）。伤后14 d,DPC组小鼠创面毛发覆盖面积为（62±7）mm2,明显大于PBS组的（35±6）mm2（t=2.89,P<0.05）。伤后14 d,与PBS组比较,DPC组小鼠创面组织中新生毛囊数量明显增多（t=5.43,P<0.05）,真皮层胶原沉积面积明显缩小（t=3.56,P<0.05）。伤后14 d,免疫荧光法和蛋白质印迹法检测均显示,DPC组小鼠创面组织中β连环蛋白（t值分别为5.49、4.25,P值均<0.05）和Lef1（t值分别为7.50、11.54,P值均<0.05）的蛋白表达均明显高于PBS组；DPC组小鼠创面组织中β连环蛋白和Lef1的mRNA表达均明显高于PBS组（t值分别为7.68、9.67,P<0.05）。 结论 DPC通过激活Wnt/β连环蛋白信号通路加快小鼠全层皮肤缺损创面再上皮化,并促进创面愈合过程中的毛囊再生。 -
关键词:
- 创伤和损伤 /
- 伤口愈合 /
- 淋巴样增强子结合因子1 /
- 胶原 /
- 毛囊再生 /
- 毛乳头细胞 /
- Wnt/β连环蛋白信号通路
Abstract:Objective To explore the influence and its mechanism of allogeneic dermal papilla cells (DPCs) on the wound healing of full-thickness skin defects in mice. Methods This study was an experimental study. DPCs were isolated from the whisker follicles of five 6-week-old male C57BL/6J mice by combining microdissection with collagenase digestion and were successfully identified. Eighteen 8-week-old male C57BL/6J mice were divided into phosphate buffer solution (PBS) group and DPC group according to the random number table, with 9 mice in each group, and the full-thickness skin defect wound model was created on the back of all mice. On day 2, 4, and 6 after injury, the mice in DPC group were administered 100 μL of cell suspension containing 1×106 DPCs of the 4th passage by subcutaneous injection around the wound, and the mice in PBS group was administered an equal volume of PBS. On day 3, 7, 10, and 14 after injury, the wound healing and hair growth of mice in two groups were observed, and the residual wound area was measured, and the hair coverage area on the wound of mice in two groups was measured on day 14 after injury. On day 14 after injury, the wound tissue samples of mice in two groups were collected. Hematoxylin-eosin staining was performed to observe the condition of newborn hair follicles and the number was counted, Masson staining was performed to observe the collagen deposition in the dermis and the collagen deposition area was measured, the immunofluorescence method was used to detect the protein expressions of Wnt/β-catenin signaling pathway related molecules β-catenin and lymphoid enhancer binding factor 1 (Lef1), and Western blotting and real-time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction were used to detect the protein and mRNA expressions of β-catenin and Lef1, respectively. The number of samples in each experiment was 3. Results Compared with those in PBS group, the mice in DPC group had accelerated wound re-epithelialization at each time point after injury, and more hair growth on day 10 and 14 after injury. On day 7, 10, and 14 after injury, the residual wound areas of mice in DPC group were (13.92±2.90), (3.69±1.78), and (1.09±0.14) mm2, respectively, which were significantly smaller than (26.19±2.06), (10.84±3.59), and (6.75±2.11) mm2 in PBS group, respectively (with t values of 5.85, 3.09, and 4.63, respectively, P values all <0.05). On day 14 after injury, the hair coverage area on the wound of mice in DPC group was (62±7) mm2, which was significantly larger than (35±6) mm2 in PBS group (t=2.89, P<0.05). On day 14 after injury, compared with those in PBS group, the number of newborn hair follicles in the wound tissue of mice in DPC group was significantly increased (t=5.43, P<0.05), and the dermal collagen deposition area was significantly reduced (t=3.56, P<0.05). On day 14 after injury, both the immunofluorescence method and the Western blotting detection showed that the protein expressions of β-catenin (with t values of 5.49 and 4.25, respectively, P values all <0.05) and Lef1 (with t values of 7.50 and 11.54, respectively, P values all <0.05) in the wound tissue of mice in DPC group were significantly higher than those in PBS group; the mRNA expressions of β-catenin and Lef1 in the wound tissue of mice in DPC group were significantly higher than those in PBS group (with t values of 7.68 and 9.67, respectively, P<0.05). Conclusions DPCs can accelerate the re-epithelialization of full-thickness skin defect wounds in mice by activating Wnt/β-catenin signaling pathway and promote hair follicle regeneration during the process of wound healing. -
(1)回顾分析显示，脉冲染料激光动态联合曲安奈德治疗瘢痕疙瘩可较单纯曲安奈德注射治疗缩短显效时间，减少曲安奈德注射次数，增加随访次数，提高患者依从性。
(2)通过与单纯曲安奈德注射治疗效果对比，为脉冲染料激光动态联合曲安奈德治疗瘢痕疙瘩的临床深入应用提供了参考依据。
瘢痕疙瘩是一种特殊的病理性瘢痕，不仅影响患者外观及功能，还对患者生活造成影响［1, 2］。目前瘢痕疙瘩治疗方法众多［3］，但单一治疗方式往往难以达到满意的疗效，个体化、综合性动态治疗已成为瘢痕疙瘩治疗的趋势［4, 5］。糖皮质激素类药物瘢痕内局部注射是瘢痕疙瘩综合性治疗的常用方法，曲安奈德则是使用最广泛的糖皮质类激素［6］。但单独注射糖皮质激素治疗瘢痕疙瘩的耗时较长，不良反应较多，且愈后瘢痕疙瘩的复发率较高［5］。近年来的研究表明，糖皮质激素类药物瘢痕内注射联合激光治疗模式，可提高治疗效果并减少不良反应［7］。目前，脉冲染料激光（PDL）已成为瘢痕疙瘩综合性治疗中的主要激光之一［8］。不同于皮肤血管性疾患，瘢痕疙瘩具有自身特殊性，如质地较硬且厚等；采用PDL治疗瘢痕疙瘩可能难以达到治疗深度而影响治疗效果，且不恰当的治疗时机以及过激的照射可能激发炎症反应反而加重病情。因此，PDL在瘢痕疙瘩综合动态治疗中的临床应用及疗效尚需进一步探索。本研究拟通过分析PDL动态联合曲安奈德在非手术瘢痕疙瘩患者治疗中的应用效果，探讨该动态疗法在瘢痕疙瘩的个体化综合治疗方案中的有效性。
1. 对象与方法
本回顾性观察性研究符合《赫尔辛基宣言》的基本原则。根据河南大学淮河医院伦理委员会的相关规定，可以在不泄露患者身份的前提下分析、使用相关临床资料。
1.1 入选标准
纳入标准：（1）接受非手术治疗的瘢痕疙瘩患者；（2）随访时间≥1年，临床资料数据完整的患者；（3）至少进行过1次PDL+曲安奈德联合治疗或者单纯曲安奈德注射治疗。排除标准：（1）免疫缺陷患者或6个月内接受过其他治疗患者；（2）合并心脏病、糖尿病等原发性基础性疾病患者。
1.2 临床资料与分组
2015年4月—2020年10月，河南大学淮河医院收治34例符合入选标准的瘢痕疙瘩患者，共46处瘢痕疙瘩，瘢痕疙瘩病程为2~240个月。根据采用的治疗方式，将患者分为曲安奈德组（18例）与动态治疗组（16例），前一组患者中男8例、女10例，年龄（30±12）岁，与后一组患者中男6例、女10例的性别分布（P=0.738）及（26±11）岁的年龄（t=0.89，P=0.382）相近。曲安奈德组、动态治疗组患者瘢痕疙瘩数分别为26、20个，病程分别为36.0（24.0，51.0）、42.0（19.5，120.0）个月（Z=-0.64，P=0.524），初诊体积分别为0.52（0.20，1.53）、0.66（0.17，1.54）cm3（Z=-0.06，P=0.956）；曲安奈德组患者瘢痕疙瘩分布在前胸（11个）与肩背、耳、下颌（各3个）以及颈、腹、四肢（各2个），与动态治疗组患者前胸（13个）、肩背（3个）、耳（2个）及颈与会阴（各1个）的部位分布相近（χ2=7.08，P=0.424）；曲安奈德组患者瘢痕疙瘩随访时间为26.0（15.0，37.8）个月，明显长于动态治疗组的15.0（12.0，24.5）个月（Z=-2.78，P=0.005）。
1.3 治疗方法
（1）曲安奈德组：将5 mL质量浓度为10 mg/mL的曲安奈德与5 mL质量浓度为20 g/L的利多卡因混合配制成注射混合液，根据瘢痕大小选择适当的注射范围。采用多点分层注射法，尽可能覆盖患处。边退针边注射，至瘢痕组织苍白充盈为止，注射量为2 mg/cm2，每次注射总量不高于40 mg。建议该组患者1个月治疗1次并行治疗前温哥华瘢痕量表（VSS）评分。（2）动态治疗组：每次治疗前，采用VSS评估瘢痕情况，据此选择治疗方式。若仅厚度和/或柔软度>2分，则仅同前给予曲安奈德注射治疗；若仅色泽和/或血管分布>2分，则仅给予PDL治疗；若厚度和/或柔软度>2分且色泽和/或血管分布>2分，则给予PDL+曲安奈德联合治疗［9］；若厚度、柔软度、色泽、血管分布各项评分均<2分，则不进行治疗。PDL治疗中使用595 nm PDL治疗仪，选择光斑直径7 mm、脉冲宽度1.5~30.0 ms、能量密度8.5~13.5 J/cm2，以出现轻度紫癜为治疗终点。PDL+曲安奈德联合治疗中先进行同前PDL治疗后，即刻冷敷30 min，之后继续行前述曲安奈德注射治疗。建议该组患者每个月就诊接受评估。
1.4 评估指标
1.4.1 瘢痕疙瘩评分
首次治疗前及首次治疗后（以下简称治疗前与治疗后）12个月，由2名未参与治疗的河南大学淮河医院整形修复外科医师使用同一台数码相机拍摄患者瘢痕疙瘩照片，并采用VSS、患者与观察者瘢痕评估量表（POSAS）评估瘢痕疙瘩情况［10］。VSS包含厚度、柔软度、色泽、血管分布条目，总分为0~15分［11］；POSAS包含观察者量表和患者量表，观察者量表包括血管分布、色泽、厚度、表面粗糙度、柔软度和表面积条目，患者量表包括疼痛程度、瘙痒程度、颜色、硬度、厚度及自我感受条目，总分为12~120分［10］。结果记录总评分及各量表中色泽和血管分布总分。总分越低越好。
1.4.2 生活质量评分
同1.4.1中时间，由1.4.1中医师采用皮肤病生活质量指数（DLQI）量表评估瘢痕疙瘩对患者生活质量的影响情况。DLQI量表共有10个问题，包括症状感受、日常活动、休闲娱乐、工作学习、人际关系及治疗维度，总分为0~30分［12］。总分越低越好。
1.4.3 疗效评价
治疗后12个月，依据VSS评分进行瘢痕疙瘩疗效评价并计算显效率。VSS总评分11~15分为无效，6~10分为好转，1~5分为显效，0分为痊愈［13］；显效率=（显效瘢痕疙瘩数+痊愈瘢痕疙瘩数）÷瘢痕疙瘩总数×100%。
1.4.4 首次显效时间及达到首次显效时曲安奈德累计注射次数
记录瘢痕疙瘩首次达到显效所花的治疗时间、从治疗开始至首次达到显效期间所注射的曲安奈德次数。
1.4.5 随访次数及不良反应
记录瘢痕疙瘩治疗后12个月内随访次数（以此体现患者依从性）与不良反应发生情况并计算不良反应发生率。PDL治疗后可能出现水疱、紫癜、色素沉着等不良反应，曲安奈德治疗后可能出现皮质醇增多症、毛细血管扩张、局部凹陷、色素沉着或脱失、药物沉渣等不良反应。同一个瘢痕疙瘩多次发生同一种不良反应只计1次。不良反应发生率=不良反应发生次数÷瘢痕疙瘩总数×100%。
1.5 统计学处理
采用SPSS 24.0统计软件进行数据分析。计量资料数据中符合正态分布者用
2. 结果
2.1 瘢痕疙瘩评分
曲安奈德组、动态治疗组患者瘢痕疙瘩治疗后12个月的VSS总评分均较治疗前明显降低（t值分别为7.53、8.09，P<0.001），VSS、POSAS中色泽和血管分布总分与POSAS总评分均较治疗前明显降低（Z值分别为-3.71、-4.04、-4.21，-3.76、-3.73、-3.92，P<0.001）。2组患者瘢痕疙瘩治疗前、治疗后12个月的VSS、POSAS总评分以及治疗前VSS、POSAS中色泽和血管分布总分均相近（P>0.05），动态治疗组患者治疗后12个月瘢痕疙瘩的VSS、POSAS中色泽和血管分布总分均明显低于曲安奈德组（P<0.05）。见表1。
表1 2组瘢痕疙瘩患者首次治疗前后瘢痕疙瘩评分比较（分）组别 瘢痕疙瘩数（个） VSS总评分（ VSS中色泽和血管分布总分［M（Q1，Q3）］ POSAS总评分［M（Q1，Q3）］ POSAS中色泽和血管分布总分［M（Q1，Q3）］ 治疗前 治疗后12个月 治疗前 治疗后12个月 治疗前 治疗后12个月 治疗前 治疗后12个月 曲安奈德组 26 9.1±1.2 5.3±2.7a 4.00（4.00，4.25） 3.00（1.00，3.25）a 60.5（54.0，65.0） 37.0（22.5，52.8）a 14.0（13.0，17.0） 11.0（6.8，12.5）a 动态治疗组 20 9.4±1.7 4.8±2.7a 4.00（4.00，5.00） 1.00（1.00，2.00）a 60.5（49.5，80.0） 30.0（22.8，38.8）a 14.0（14.0，16.8） 6.0（3.5，9.0）a 统计量值 t=-0.55 t=0.54 Z=-0.07 Z=-2.03 Z=-0.52 Z=-0.37 Z=-0.17 Z=-2.12 P值 0.587 0.593 0.941 0.042 0.602 0.593 0.866 0.034 注：动态治疗组疗法包括行曲安奈德注射、脉冲染料激光（PDL）或者PDL联合曲安奈德注射治疗；VSS为温哥华瘢痕量表，POSAS为患者与观察者瘢痕评估量表；与治疗前比较，aP<0.01 2.2 生活质量评分
曲安奈德组、动态治疗组患者瘢痕疙瘩治疗后12个月DLQI量表评分分别为4.0（0，10.0）、3.0（2.0，6.8）分，均明显低于治疗前的12.0（8.0，13.0）和10.0（9.0，11.0）分（Z值分别为-4.11、-3.93，P<0.001）。2组患者治疗前、治疗后12个月DLQI量表评分均相近（Z值分别为-1.02、-0.09，P值分别为0.309、0.930）。
2.3 疗效评价
治疗后12个月，曲安奈德组患者瘢痕疙瘩达到显效者12个（46.15%）、好转者12个（46.15%）、无效者2个（7.70%），显效率为46.15%（12/26）；动态治疗组患者瘢痕疙瘩达到痊愈者2个（10.00%）、显效者13个（65.00%）、好转者4个（20.00%）、无效者1个（5.00%），显效率为75.00%（15/20），明显高于曲安奈德组（Z=3.88，P=0.047）。
2.4 首次显效时间及达到首次显效时曲安奈德累计注射次数
动态治疗组患者瘢痕疙瘩首次显效时间为5.5（2.0，6.0）个月，明显短于曲安奈德组的6.0（2.3，10.3）个月（Z=4.02，P=0.045）。动态治疗组患者瘢痕疙瘩达到首次显效时曲安奈德累计注射次数为（3.2±1.7）次，明显少于曲安奈德组的（4.2±1.8）次（t=2.09，P=0.043）。
2.5 随访次数及不良反应
动态治疗组患者瘢痕疙瘩治疗后12个月内随访次数为（6.5±2.1）次，明显多于曲安奈德组的（5.0±1.4）次（t=-2.94，P=0.005）。
治疗后12个月内，2组患者均未出现皮质醇增多症等全身性不良反应，动态治疗组患者激光治疗后未出现水疱等不良反应。动态治疗组患者瘢痕疙瘩治疗后12个月内5种不良反应发生率及总不良反应发生率均低于曲安奈德组，但差异均无统计学意义（P>0.05）。见表2。
表2 2组瘢痕疙瘩患者首次治疗后12个月内不良反应发生情况[次（%）]组别 瘢痕疙瘩数（个） 毛细血管扩张 色素沉着 局部凹陷 药物沉渣 色素脱失 总不良反应 曲安奈德组 26 7（26.92） 4（15.38） 2（7.69） 2（7.69） 2（7.69） 17（65.38） 动态治疗组 20 2（10.00） 2（10.00） 1（5.00） 1（5.00） 1（5.00） 7（35.00） P值 0.262 0.684 >0.999 >0.999 >0.999 0.073 注：动态治疗组疗法包括行曲安奈德注射、脉冲染料激光（PDL）或者PDL联合曲安奈德注射治疗 2.6 典型病例
例1
女，33岁，前胸部表面皮肤毛囊炎后形成瘢痕疙瘩14年余，瘢痕疙瘩体积约为2.40 cm3，偶伴瘙痒、疼痛等症状，因采用的治疗方式被纳入动态治疗组。治疗前VSS、POSAS总评分分别为10、64分，VSS、POSAS中色泽和血管分布总分分别为4、13分，DLQI评分10分，行PDL联合曲安奈德注射治疗。治疗后1个月，瘢痕疙瘩质地有所软化，厚度变薄，基本平整，颜色得到改善，VSS总评分为6分，继续进行前述联合治疗。治疗后2个月，瘢痕疙瘩平整，质地柔软，颜色改善，VSS总评分为3分，此时首次达到显效（累计注射2次曲安奈德）。治疗后3~5个月随访未治疗，至治疗后6个月，瘢痕疙瘩稍突出皮面，色泽加深伴血管增生，VSS总评分为5分，再次给予联合治疗。之后随访（治疗后7、9个月未随访），至治疗后12个月，瘢痕疙瘩趋于平稳，VSS、POSAS总评分分别为4、20分，VSS、POSAS中色泽和血管分布总分分别为2、5分，DLQI评分4分；治疗后12个月内，随访10次，未发生不良反应。治疗后24个月，VSS总评分为4分，瘢痕疙瘩趋于平稳，未见复发迹象。见图1。
1 例1动态治疗组患者前胸部表面皮肤毛囊炎后形成瘢痕疙瘩首次治疗前后情况。1A.治疗前，瘢痕疙瘩明显高于体表，充血明显；1B.行脉冲染料激光联合曲安奈德注射治疗后1个月，瘢痕疙瘩厚度变薄，颜色得到改善；1C.治疗后2个月，瘢痕疙瘩平整，颜色改善，达到显效例2
女，45岁，不明原因导致肩背部形成瘢痕疙瘩10年余，瘢痕疙瘩体积约为10.18 cm3，偶伴瘙痒，无疼痛等症状，因采用的治疗方式被纳入曲安奈德组。治疗前VSS、POSAS总评分分别为11、71分，VSS、POSAS中色泽和血管分布总分分别为5、14分，DLQI评分13分，患者拒绝激光治疗，仅接受局部曲安奈德注射治疗。治疗后1个月，瘢痕疙瘩颜色加深，厚度变厚，硬度变硬，VSS总评分为12分，继续给予注射治疗。治疗后2~7个月，瘢痕疙瘩逐渐趋于平整，质地逐渐变软，颜色逐渐改善，但VSS总评分均>5分，在此期间继续每个月给予1次曲安奈德注射治疗。治疗后8、9个月未随访。治疗后10个月，瘢痕疙瘩变平整，质地软，颜色变淡，VSS总评分为5分，此时首次达到显效（累计注射7次曲安奈德）。治疗后11个月随访未治疗，至治疗后12个月，瘢痕疙瘩趋于平稳，未见复发迹象，VSS、POSAS总评分分别为5、26分，VSS、POSAS中色泽和血管分布总分分别为2、5分，DLQI评分5分；治疗后12个月内，随访10次，出现毛细血管扩张不良反应。治疗后24个月，瘢痕疙瘩突出皮面，VSS总评分为7分，再次给予曲安奈德注射治疗。之后几个月随访未治疗，至治疗后27个月，VSS总评分为4分，瘢痕疙瘩趋于平稳，未见复发迹象。见图2。
2 例2曲安奈德组患者肩背部不明原因所致瘢痕疙瘩首次治疗前后情况。2A.治疗前，瘢痕疙瘩明显高出体表，色泽较深；2B.行曲安奈德注射治疗后1个月，瘢痕疙瘩色泽加深，厚度变厚；2C.治疗后2个月，瘢痕疙瘩稍平整，颜色改善；2D.治疗后7个月，瘢痕疙瘩颜色改善；2E.治疗后10个月，瘢痕疙瘩变平整，颜色淡，达到显效3. 讨论
瘢痕疙瘩是一种纤维化疾病［14］，全球发生率为0.09%~16%［15］，其临床特征为超出原始损伤范围，突出皮肤表面，呈侵袭性生长且无自发消退性［16］。90%瘢痕疙瘩组织中存在线性并且相对平行于皮肤表面的血管结构［17］。瘢痕疙瘩组织中持续存在增多的微血管、Fb及炎症细胞［18］，且由边缘到中心区域逐渐减少，提示瘢痕疙瘩组织内持续存在炎症反应［19］。曲安奈德是目前最为常用的瘢痕疙瘩局部注射药物，其作用机制主要是干扰炎症细胞的迁移与吞噬，并通过抑制血管再形成，造成瘢痕疙瘩区域营养供给障碍［20］。Ogawa和Akaishi［19］认为，在创面愈合的炎症反应阶段，局部因素（如高张力、遗传因素等）导致血管内皮细胞功能障碍，致使血管通透性增高，进而加速炎症细胞及炎症因子聚集，最终使Fb聚集，ECM增多。因此，在瘢痕疙瘩的炎症反应期局部注射曲安奈德可有效抑制局部炎症反应，减少胶原合成及ECM沉积。但糖皮质激素产生的全身性及局部不良反应不容忽视，这也限制了其应用。
近年来，PDL越来越多地被应用于瘢痕疙瘩治疗中［5，21, 22］，其治疗瘢痕疙瘩的效果亦逐渐被认可，相关机制主要有以下几个方面：（1）PDL可被血管中血红蛋白选择性吸收，从而引起血管受热闭塞［23, 24］。（2）PDL可促使G0/G1期的细胞比例升高，抑制组织中Fb增殖，减少ECM沉积［25］；（3）PDL可降低TGF-β1分泌量，增加TGF-β3分泌量，进而抑制胶原生成［26, 27］。PDL治疗瘢痕疙瘩不仅效果显著，且能有效减少激素注射后的不良反应［5］。因局部激素注射后，组织内压增加，毛细血管不充盈，无法特异性吸收激光能量，因此有学者研究提出PDL治疗后联合曲安奈德注射治疗的模式［28］。Blanco de Tord等［21］治疗1例难治性耳郭瘢痕疙瘩患者时，应用PDL治疗后局部注射0.5 mL曲安奈德，6个月后疗效显著且未见复发。本研究中，根据首次显效时间及达到首次显效时曲安奈德累计注射次数的对比分析可见，相对于单纯曲安奈德治疗，PDL动态联合曲安奈德治疗可缩短瘢痕疙瘩治疗时间，减少激素注射次数。VSS、POSAS中色泽和血管分布总分统计结果显示，动态治疗优于单纯曲安奈德治疗，提示PDL可能是通过对局部血管的治疗作用而提高瘢痕疙瘩的临床疗效的。这与Khattab等［22］的研究结果一致，其研究结果表明，PDL联合局部注射维拉帕米较单独注射维拉帕米治疗瘢痕疙瘩，可显著减少局部血管分布。
瘢痕的发生发展是一个渐进和长期的病理过程，需要对其进行持续、充分的治疗。易复发性是瘢痕疙瘩的特点，瘢痕疙瘩的综合动态治疗是目前的趋势，而定期随访、动态评估、及时干预是综合动态治疗的核心［9］。本研究中采用动态治疗模式，根据VSS评估结果及瘢痕疙瘩临床症状制订不同的随访及治疗计划。与传统PDL+曲安奈德联合治疗模式［21，29］相比，本研究中的动态治疗模式根据患者实际病情，决定其治疗内容，避免了因不恰当时机的激光照射刺激而加重临床症状的发生。Muneuchi等［30］采用曲安奈德注射治疗94例瘢痕疙瘩患者，治疗间隔≥4周，结果显示31例患者在10次注射治疗内放弃治疗，原因是患者难以忍受注射时的疼痛，以及在短期内没有看到明显疗效。本研究结果显示，接受动态治疗的患者依从性高于仅接受曲安奈德注射治疗的患者；且本课题组临床研究显示仅接受曲安奈德注射治疗患者的放弃治疗率为43.75%（14/32），高于动态治疗组的20.00%（4/20），另文发表。这可能与接受动态治疗的患者曲安奈德注射次数减少从而减轻了注射痛苦，短时间治疗有明显的症状改善增加了患者信心，使得患者更易接受治疗有关。患者依从性提高可使随访率增高，便于及时评估病情选择适当治疗方式，进一步提高患者临床疗效，从而达到良性循环。本研究结果提示了PDL动态联合曲安奈德注射治疗在综合性动态治疗中的优势。
本研究纳入的瘢痕疙瘩患者在接受不同方式治疗后，均未出现全身性不良反应如皮质醇增多症等。动态治疗组患者的5种不良反应、总不良反应发生率低于曲安奈德组，其原因可能与接受动态治疗的患者曲安奈德注射次数减少、曲安奈德注射总量减少有关。动态治疗组患者瘢痕疙瘩毛细血管扩张的发生率亦低于曲安奈德组，且此并发症可通过PDL治疗得以改善，提示了PDL动态联合曲安奈德治疗的优势。然而该不良反应结果缺乏统计学意义，可能与本研究样本量较少有关，尚需进一步研究验证。
综上所述，与单纯曲安奈德注射治疗比较，PDL动态联合曲安奈德治疗瘢痕疙瘩可减少曲安奈德注射次数，缩短疗程，提高患者依从性，进而提高瘢痕疙瘩治疗效果。然而本研究是基于现有样本量的回顾性研究，样本量较少，结果存在一定的局限性，且动态治疗中2种疗法如何相互作用尚不明确，还需要进一步研究。未来，本研究团队拟加大样本量并且以更加客观的指标对疗效进行评价，以提高研究结果的准确性。
尚亚鸽、张丽霞：实验操作与论文撰写；韩超、李梦洋：数据整理、统计学分析；罗亮、王许杰：研究指导、技术支持；胡大海：实验设计、论文修改、经费支持所有作者均声明不存在利益冲突 -
参考文献
(38) [1] HsuYC,FuchsE.Building and maintaining the skin[J].Cold Spring Harb Perspect Biol,2022,14(7):a040840.DOI: 10.1101/cshperspect.a040840. [2] ZhangB,ChenT.Local and systemic mechanisms that control the hair follicle stem cell niche[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2024,25(2):87-100.DOI: 10.1038/s41580-023-00662-3. [3] YangG,ChenH,ChenQ,et al.Injury-induced interleukin-1 alpha promotes Lgr5 hair follicle stem cells de novo regeneration and proliferation via regulating regenerative microenvironment in mice[J].Inflamm Regen,2023,43(1):14.DOI: 10.1186/s41232-023-00265-7. [4] MonavarianM,KaderS,MoeinzadehS,et al.Regenerative scar-free skin wound healing[J].Tissue Eng Part B Rev,2019,25(4):294-311.DOI: 10.1089/ten.TEB.2018.0350. [5] ParkS.Hair follicle morphogenesis during embryogenesis, neogenesis, and organogenesis[J].Front Cell Dev Biol,2022,10:933370.DOI: 10.3389/fcell.2022.933370. [6] AamarE,Avigad LaronE,AsaadW,et al.Hair-follicle mesenchymal stem cell activity during homeostasis and wound healing[J].J Invest Dermatol,2021,141(12):2797-2807.e6.DOI: 10.1016/j.jid.2021.05.023. [7] 戴娇娇,王玲,邱海洋,等.自体毛囊单位提取移植术治疗烧伤后小面积继发性瘢痕秃发的临床效果[J].中华烧伤与创面修复杂志,2022,38(6):532-537.DOI: 10.3760/cma.j.cn501120-20210224-00064. [8] LiuZ,HuangJ,KangD,et al.Microenvironmental reprogramming of human dermal papilla cells for hair follicle tissue engineering[J].Acta Biomater,2023,165:31-49.DOI: 10.1016/j.actbio.2022.11.004. [9] NgKJ,LimJ,TanYN,et al.Sox2 in the dermal papilla regulates hair follicle pigmentation[J].Cell Rep,2022,40(3):111100.DOI: 10.1016/j.celrep.2022.111100. [10] JiS,ZhuZ,SunX,et al.Functional hair follicle regeneration: an updated review[J].Signal Transduct Target Ther,2021,6(1):66.DOI: 10.1038/s41392-020-00441-y. [11] WangB,LiuXM,LiuZN,et al.Human hair follicle-derived mesenchymal stem cells: isolation, expansion, and differentiation[J].World J Stem Cells,2020,12(6):462-470.DOI: 10.4252/wjsc.v12.i6.462. [12] DuL,GanY,ZhengB,et al.An optimized force-triggered density gradient sedimentation method for isolation of pelage follicle dermal papilla cells from neonatal mouse skin[J].Stem Cell Res Ther,2023,14(1):140.DOI: 10.1186/s13287-023-03343-2. [13] ZhengB,YangL,FengS,et al.Organoid‐loaded cryomicroneedles for biomimic hair regeneration[J].Advanced Functional Materials,2024,34(3):2304950.1-2304950.21.DOI: 10.1002/adfm.202304950. [14] 巫琦松,肖顺娥,魏在荣.毛囊及毛囊源性细胞促进创面愈合的研究进展[J].中国美容整形外科杂志,2020,31(1):59-62.DOI: 10.3969/j.issn.1673-7040.2020.01.018. [15] OakA,CotsarelisG.Wound-induced hair neogenesis: a portal to the development of new therapies for hair loss and wound regeneration[J].Cold Spring Harb Perspect Biol,2023,15(2):a041239.DOI: 10.1101/cshperspect.a041239. [16] LimC,LimJ,ChoiS.Wound-induced hair follicle neogenesis as a promising approach for hair regeneration[J].Mol Cells,2023,46(10):573-578.DOI: 10.14348/molcells.2023.0071. [17] XueY,LimCH,PlikusMV,et al.Wound-induced hair neogenesis model[J].J Invest Dermatol,2022,142(10):2565-2569.DOI: 10.1016/j.jid.2022.07.013. [18] MaoMQ,JingJ,MiaoYJ,et al.Epithelial-mesenchymal interaction in hair regeneration and skin wound healing[J].Front Med (Lausanne),2022,9:863786.DOI: 10.3389/fmed.2022.863786. [19] YangL,MiaoY,LiuY,et al.Regenerating hair in prevascularized tissue space formed by a controllable foreign body reaction[J].Advanced Functional Materials,2021,31(8):2007483. DOI: 10.1002/adfm.202007483. [20] KangD,LiuZ,QianC,et al.3D bioprinting of a gelatin-alginate hydrogel for tissue-engineered hair follicle regeneration[J].Acta Biomater,2023,165:19-30.DOI: 10.1016/j.actbio.2022.03.011. [21] PetersonA,NairLS.Hair follicle stem cells for tissue regeneration[J].Tissue Eng Part B Rev,2022,28(4):695-706.DOI: 10.1089/ten.TEB.2021.0098. [22] GanY,WangH,DuL,et al.Cellular heterogeneity facilitates the functional differences between hair follicle dermal sheath cells and dermal papilla cells: a new classification system for mesenchymal cells within the hair follicle niche[J].Stem Cell Rev Rep,2022,18(6):2016-2027.DOI: 10.1007/s12015-022-10411-2. [23] ChoiS,YoonM,ChoiKY.Approaches for regenerative healing of cutaneous wound with an emphasis on strategies activating the Wnt/β-catenin pathway[J].Adv Wound Care (New Rochelle),2022,11(2):70-86.DOI: 10.1089/wound.2020.1284. [24] 伍倩,谭晓宇,王怡佳,等.Wnt/β连环蛋白信号通路在体表创面愈合中的作用机制研究进展[J].中华烧伤与创面修复杂志,2023,39(2):190-195.DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20220816-00348. [25] BejaouiM,VillarealMO,IsodaH.β-catenin-mediated hair growth induction effect of 3,4,5-tri-O-caffeoylquinic acid[J].Aging (Albany NY),2019,11(12):4216-4237.DOI: 10.18632/aging.102048. [26] WuZ,ZhuY,LiuH,et al.Wnt10b promotes hair follicles growth and dermal papilla cells proliferation via Wnt/β-Catenin signaling pathway in Rex rabbits[J].Biosci Rep,2020,40(2):BSR20191248.DOI: 10.1042/BSR20191248. [27] PhanQM,FineGM,SalzL,et al.Lef1 expression in fibroblasts maintains developmental potential in adult skin to regenerate wounds[J].Elife,2020,9:e60066.DOI: 10.7554/eLife.60066. [28] HaoYH,Lafita-NavarroMC,ZachariasL,et al.Induction of LEF1 by MYC activates the WNT pathway and maintains cell proliferation[J].Cell Commun Signal,2019,17(1):129.DOI: 10.1186/s12964-019-0444-1. [29] MascharakS,TalbottHE,JanuszykM,et al.Multi-omic analysis reveals divergent molecular events in scarring and regenerative wound healing[J].Cell Stem Cell,2022,29(2):315-327.e6.DOI: 10.1016/j.stem.2021.12.011. [30] 刘琰,刘欣盈.细胞治疗与创面修复[J].中华烧伤与创面修复杂志,2024,40(3):221-229.DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20240108-00009. [31] HassanshahiA,HassanshahiM,KhabbaziS,et al.Adipose-derived stem cells for wound healing[J].J Cell Physiol,2019,234(6):7903-7914.DOI: 10.1002/jcp.27922. [32] LimCH,SunQ,RattiK,et al.Hedgehog stimulates hair follicle neogenesis by creating inductive dermis during murine skin wound healing[J].Nat Commun,2018,9(1):4903.DOI: 10.1038/s41467-018-07142-9. [33] MadaanA,VermaR,SinghAT,et al.Review of hair follicle dermal papilla cells as in vitro screening model for hair growth[J].Int J Cosmet Sci,2018,40(5):429-450.DOI: 10.1111/ics.12489. [34] ZhangL,WangWH,JinJY,et al.Induction of hair follicle neogenesis with cultured mouse dermal papilla cells in de novo regenerated skin tissues[J].J Tissue Eng Regen Med,2019,13(9):1641-1650.DOI: 10.1002/term.2918. [35] XingF,YiWJ,MiaoF,et al.Baicalin increases hair follicle development by increasing canonical Wnt/β-catenin signaling and activating dermal papillar cells in mice[J].Int J Mol Med,2018,41(4):2079-2085.DOI: 10.3892/ijmm.2018.3391. [36] XiaoS,HuZ,JiangJ,et al.Neonatal murine skin-derived cells transplanted using a mini-chamber model produce robust and normal hair[J].J Tissue Eng Regen Med,2016,10(5):E286-293.DOI: 10.1002/term.1802. [37] LiJ,ZhaoB,DaiY,et al.Exosomes derived from dermal papilla cells mediate hair follicle stem cell proliferation through the Wnt3a/β-catenin signaling pathway[J].Oxid Med Cell Longev,2022,2022:9042345.DOI: 10.1155/2022/9042345. [38] ZhouL,WangH,JingJ,et al.Regulation of hair follicle development by exosomes derived from dermal papilla cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2018,500(2):325-332.DOI: 10.1016/j.bbrc.2018.04.067. -
图 1 小鼠毛乳头细胞的生长及标志物表达情况。1A.毛乳头组织培养7 d后,细胞呈短梭形,围绕组织块密集生长 倒置荧光显微镜×40；1B.成脂诱导培养2周后,细胞内可见脂滴（红色）形成 油红O×100；1C.成骨诱导培养3周后,细胞内可见钙结节（红色）形成 茜素红×100；1D.细胞中碱性磷酸酶（灰色）表达为阳性 对硝基苯磷酸二钠×40；1E、1F、1G、1H.分别为细胞中多能蛋白聚糖（红色）、CD133（红色）、β连环蛋白（绿色）及碱性磷酸酶（红色）表达情况,均为阳性 花青素3-异硫氰酸荧光素-4',6-二脒基-2-苯基吲哚×100
图 2 2组全层皮肤缺损小鼠伤后各时间点创面愈合及毛发生长情况。2A、2B、2C.分别为PBS组伤后3、7、14 d创面形态,创面逐渐愈合,并可见新生毛发生长；2D、2E、2F.分别为DPC组伤后3、7、14 d创面形态,与图2A、2B、2C相比,图2D、2E、2F创面面积均更小,且图2F可见更多毛发生长
注：分别于伤后2、4、6 d,通过创面周围皮下注射给予毛乳头细胞（DPC）组小鼠DPC、磷酸盐缓冲液（PBS）组小鼠PBS；各图中圆环为防止创面快速收缩的硅胶环
图 3 2组全层皮肤缺损小鼠伤后14 d创面组织中新生毛囊及胶原沉积情况。3A、3B.分别为PBS组、DPC组新生毛囊情况,图3B中新生毛囊的数量明显多于图3A 苏木精-伊红×10；3C、3D.分别为PBS组、DPC组胶原沉积情况,图3C真皮层新生胶原的含量明显多于图3D Masson×10；3E、3F.分别为图3A、3B中方框中图形的放大图,图3E中无新生毛囊结构形成,而图3F中可见新生毛囊结构形成 苏木精-伊红×100；3G、3H.分别为图3C、3D中方框中图形的放大图,图3G中胶原排列致密、紊乱,图3H中胶原排列疏松 Masson ×100
注：分别于伤后2、4、6 d,通过创面周围皮下注射给予毛乳头细胞（DPC）组小鼠DPC、磷酸盐缓冲液（PBS）组小鼠PBS
图 4 2组全层皮肤缺损小鼠伤后14 d创面组织中β连环蛋白与Lef1的蛋白表达情况。4A、4B.分别为PBS组、DPC组β连环蛋白荧光表达情况,图4B中β连环蛋白荧光强度明显强于图4A Alexa Fluor 594-4',6-二脒基-2-苯基吲哚×100；4C、4D.分别为PBS组、DPC组Lef1荧光表达情况,图4D中Lef1荧光强度明显强于图4C Alexa Fluor 488-4',6-二脒基-2-苯基吲哚×100
注：分别于伤后2、4、6 d,通过创面周围皮下注射给予毛乳头细胞（DPC）组小鼠DPC、磷酸盐缓冲液（PBS）组小鼠PBS；Lef1为淋巴增强结合因子1；Lef1阳性染色为绿色,β连环蛋白阳性染色为红色,细胞核阳性染色为蓝色
图 5 蛋白质印迹法检测的2组全层皮肤缺损小鼠伤后14 d创面组织中β连环蛋白与Lef1的蛋白表达
注：分别于伤后2、4、6 d,通过创面周围皮下注射给予毛乳头细胞（DPC）组小鼠DPC、磷酸盐缓冲液（PBS）组小鼠PBS；Lef1为淋巴增强结合因子1,GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶；条带上方1、2、3指示PBS组3个样本,4、5、6指示DPC组3个样本
Table 1. 采用实时荧光定量反转录PCR法检测细胞因子mRNA表达的引物序列与产物大小
引物名称 引物序列（5'→3'） 产物大小（bp） β连环蛋白 上游：GTGGTCATCGCCACCTTAATA 101 下游：TTCTCGCTGTTGGAGTTCAG 淋巴增强结合因子1 上游：TCTGCTGACATTTGCCTCTAC 103 下游：GCTGGTGGATGGCTCTTATATT 3-磷酸甘油醛脱氢酶 上游：GGTGAAGGTCGGTGTGAACG 179 下游：CTCGCTCCTGGAAGATGGTG 
下载: 导出CSV
-
下载:
计量
- 文章访问数: 8821
- HTML全文浏览量: 63
- PDF下载量: 11
- 被引次数: 0
