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异体毛乳头细胞对小鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响及其机制

尚亚鸽 张丽霞 韩超 李梦洋 罗亮 王许杰 胡大海

王晓阳, 扈煜婕, 王晓川, 等. 糖尿病大鼠创面组织的靶向能量代谢组学研究[J]. 中华烧伤与创面修复杂志, 2025, 41(2): 137-144. DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20241014-00385.
引用本文: 尚亚鸽, 张丽霞, 韩超, 等. 异体毛乳头细胞对小鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响及其机制[J]. 中华烧伤与创面修复杂志, 2024, 40(8): 772-780. DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20240215-00059.
Wang XY,Hu YJ,Wang XC,et al.Targeted energy metabolomics study on wound tissue of diabetic rats[J].Chin J Burns Wounds,2025,41(2):137-144.DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20241014-00385.
Citation: Shang YG,Zhang LX,Han C,et al.Influence and its mechanism of allogeneic dermal papilla cells on the wound healing of full-thickness skin defects in mice[J].Chin J Burns Wounds,2024,40(8):772-780.DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20240215-00059.

异体毛乳头细胞对小鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响及其机制

doi: 10.3760/cma.j.cn501225-20240215-00059
基金项目: 

国家自然科学基金面上项目 81772071

西京医院学科助推计划医学基础研究专项课题 XJZT21J05

详细信息
    通讯作者:

    胡大海,Email:hudhai@fmmu.edu.cn

Influence and its mechanism of allogeneic dermal papilla cells on the wound healing of full-thickness skin defects in mice

Funds: 

General Program of National Natural Science Foundation of China 81772071

Xijing Hospital Discipline Promotion Program Medical Basic Research Project XJZT21J05

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  • 摘要:   目的  探索异体毛乳头细胞(DPC)对小鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响及其机制。  方法  该研究为实验研究。利用显微解剖结合胶原酶消化法自5只6周龄雄性C57BL/6J小鼠触须毛囊中提取DPC并成功鉴定。将18只8周龄雄性C57BL/6J小鼠按照随机数字表法分为磷酸盐缓冲液(PBS)组及DPC组(每组9只小鼠),在所有小鼠背部创建全层皮肤缺损创面模型。分别于伤后2、4、6 d,通过创面周围皮下注射给予DPC组小鼠含1×106个第4代DPC的细胞悬液100 μL、PBS组小鼠等体积的PBS。伤后3、7、10、14 d,观察2组小鼠创面愈合情况及毛发生长情况并测量创面剩余面积;另测量2组小鼠伤后14 d创面毛发覆盖面积。伤后14 d,收集2组小鼠创面组织标本,行苏木精-伊红染色观察新生毛囊情况并计数,行Masson染色观察真皮层胶原沉积情况并测量胶原沉积面积,采用免疫荧光法检测Wnt/β连环蛋白信号通路相关分子β连环蛋白、淋巴增强结合因子1(Lef1)的蛋白表达,分别采用蛋白质印迹法和实时荧光定量反转录PCR法检测β连环蛋白、Lef1的蛋白和mRNA表达。各实验样本数均为3。  结果  与PBS组相比,DPC组小鼠伤后各时间点创面再上皮化速度加快,且在伤后10、14 d可见更多毛发生长。伤后7、10、14 d,DPC组小鼠创面剩余面积分别为(13.92±2.90)、(3.69±1.78)、(1.09±0.14)mm2,分别明显小于PBS组的(26.19±2.06)、(10.84±3.59)、(6.75±2.11)mm2t值分别为5.85、3.09、4.63,P值均<0.05)。伤后14 d,DPC组小鼠创面毛发覆盖面积为(62±7)mm2,明显大于PBS组的(35±6)mm2t=2.89,P<0.05)。伤后14 d,与PBS组比较,DPC组小鼠创面组织中新生毛囊数量明显增多(t=5.43,P<0.05),真皮层胶原沉积面积明显缩小(t=3.56,P<0.05)。伤后14 d,免疫荧光法和蛋白质印迹法检测均显示,DPC组小鼠创面组织中β连环蛋白(t值分别为5.49、4.25,P值均<0.05)和Lef1(t值分别为7.50、11.54,P值均<0.05)的蛋白表达均明显高于PBS组;DPC组小鼠创面组织中β连环蛋白和Lef1的mRNA表达均明显高于PBS组(t值分别为7.68、9.67,P<0.05)。  结论  DPC通过激活Wnt/β连环蛋白信号通路加快小鼠全层皮肤缺损创面再上皮化,并促进创面愈合过程中的毛囊再生。

     

  • (1)靶向能量代谢组学分析显示,糖尿病大鼠创面组织中有5种差异能量代谢物顺乌头酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、5'-鸟苷二磷酸、L-苹果酸、乳酸,为理解糖尿病创面愈合的代谢机制提供了新视角。

    (2)京都基因与基因组百科全书富集分析揭示5种差异能量代谢物主要在胰高血糖素、Rap1、Ras、缺氧诱导因子1信号通路及三羧酸循环、丙酮酸代谢、线粒体自噬、胞吞作用途径中显著富集。

    Highlights:

    (1)Targeted energy metabolomics analysis revealed that there were 5 differential energy metabolites in the wound tissue of diabetic rats, including cis-aconitic acid, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, 5'-guanosine diphosphate, L-malic acid, and lactic acid. It provided a new perspective for understanding the metabolic mechanisms underlying diabetic wound healing.

    (2)Kyoto encyclopedia of genes and genomes enrichment analysis revealed that the five differential energy metabolites were significantly enriched mainly in the glucagon, Rap1, Ras, hypoxia-inducible factor 1 signaling pathways as well as the tricarboxylic acid cycle, pyruvate metabolism, mitochondrial autophagy, endocytosis pathways.

    糖尿病创面因发病率高、修复困难和愈合缓慢,严重影响患者的生活质量[1]。糖尿病创面延迟愈合与多种因素有关,包括炎症的延迟消退、氧化应激的增加以及细胞功能的失调。这些因素共同作用于创面微环境,影响细胞功能,从而阻碍创面愈合。在代谢组学研究中,通过分析糖尿病创面组织中的差异代谢物,可以揭示与抗氧化、抗炎相关的氨基酸代谢途径以及与能量代谢相关的途径,这些途径的改变可能是糖尿病创面愈合障碍的原因[2]

    一项关于代谢通路分析的研究表明,糖尿病大鼠创面组织中的差异代谢物涉及嘌呤代谢和甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸代谢及花生四烯酸代谢等,这些代谢物主要集中在与抗氧化、抗炎有关的氨基酸代谢途径中[3]。此外,胞外ATP的代谢及其相关指标在糖尿病创面修复过程中炎症反应阶段的作用引起了广泛的关注。研究表明,在糖尿病创面愈合的炎症反应阶段,炎症反应的强度不足,导致ATP、ATP水解酶以及嘌呤信号受体均处于较低水平。值得注意的是,通过外源性补充ATP,有可能在一定程度上加速小鼠糖尿病创面的愈合进程[4]。尽管如此,关于糖尿病创面组织的能量代谢状态仍没有确切定论,因此本研究团队采用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导的糖尿病大鼠的创面组织进行靶向能量代谢组学研究,筛选差异能量代谢物,旨在为糖尿病创面的诊断和治疗提供参考。

    本实验研究经山东大学第二医院(以下简称本单位)科研伦理委员会批准通过,批号:KYLL-2024049,遵循国家和本单位有关实验动物管理和使用的规定。

    6只8周龄健康无特殊病原体级、体重200~250 g的雄性SD大鼠购自济南朋悦实验动物繁育有限公司,许可证号:SCXK(鲁)2022-0006。多聚甲醛通用型组织固定液购自北京兰杰柯科技有限公司,HE和Masson染色试剂、STZ、柠檬酸钠缓冲液均购自北京索莱宝科技有限公司。C13210-01型数字切片扫描仪购自日本滨松公司。

    1.2.1   糖尿病大鼠模型的构建

    取6只大鼠,按照随机数字表法分为对照组和糖尿病组,每组3只。禁食12 h后,糖尿病组大鼠以30 mg/kg剂量腹腔注射10 mg/mL的STZ溶液,每天注射1次,连续注射3 d。对照组大鼠以相同的方式及频率注射等量柠檬酸钠缓冲液。2组大鼠均于末次注射后0(即刻)、7、9、11、13 d进行随机血糖检测及24 h内的体重、尿量、饮水量监测。糖尿病组大鼠随机血糖持续稳定≥16.7 mmol/L且表现出多饮、多尿、体重减轻的症状表示成功构建糖尿病大鼠模型。

    1.2.2   创面模型的构建

    取糖尿病组和对照组所有大鼠,采用异氟烷气体麻醉。背部皮肤常规脱毛消毒后,采用外科手术的方式,于背部正中制备1个直径2 cm的圆形全层皮肤缺损创面,使用硅胶圈及贴膜防止创面收缩。

    术后0、14 d,观察2组大鼠创面愈合情况并拍照,用Image J 1.8.0图像分析软件(美国国立卫生研究院)分析创面面积并计算术后14 d创面愈合率。术后14 d创面愈合率=(术后0 d创面面积-术后14 d创面面积)÷术后0 d创面面积×100%。术后14 d,观察创面愈合情况后,取创面及距创缘5 mm范围内的皮肤组织,并沿直径切开,一半组织用液氮冻存,用于能量代谢组学检测;另一半组织用多聚甲醛固定,用于组织病理学情况观察。

    取2组大鼠术后14 d的创面组织,常规制作厚5 μm的石蜡切片,按照试剂盒说明书进行HE及Masson染色,用数字切片扫描仪采集20倍放大倍数下的图像,分别观察创面上皮覆盖情况、Fb排列情况及胶原纤维形成、排列情况。

    取2组大鼠术后14 d的创面组织,交由杭州开泰生物技术有限公司,利用超高液相色谱-质谱联用技术行能量代谢组学检测,采用核素(琥珀酸-D6)内标法进行定量分析,采用Multiquant 3.0.2软件提取色谱峰面积,利用待测物与内标物的色谱峰面积比值以及内标物的浓度,计算待测物的表达量。筛选2组大鼠创面组织间比较,表达量有显著变化(P<0.05)的差异能量代谢物。将筛选到的差异能量代谢物提交至京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)网站进行相关通路富集分析。

    采用SPSS 22.0统计软件对数据进行处理。计量资料数据均符合正态分布,以x¯±s表示,组间总体比较行重复测量方差分析,组间两两比较行独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

    末次注射后13 d,糖尿病组大鼠精神萎靡、烦躁好动或疲乏懒动、毛发枯燥无光泽。与对照组比较,糖尿病组大鼠末次注射后7、9、11、13 d体重均显著减轻(P<0.05),饮水量及尿量均显著增加(P<0.05),血糖均>16.7 mmol/L且显著升高(P<0.05)。见表1

    Table  1.  2组大鼠末次注射链脲佐菌素后各时间点一般体征比较(x¯±s
    组别与指标鼠数(只)0 d(即刻)7 d9 d11 d13 d
    对照组3
    体重(g)242.4±2.8257.6±2.9260.7±5.0268.7±2.4273.7±4.1
    饮水量(mL)17±320±319±322±422±6
    尿量(g)17.8±1.718.0±3.917.5±2.822.3±3.118.8±2.9
    血糖(mmol/L)5.68±0.325.55±0.175.82±0.475.86±0.105.58±0.23
    糖尿病组3
    体重(g)240.3±3.1213.6±4.3210.7±5.7208.9±3.1204.4±2.3
    饮水量(mL)18±355±860±354±657±6
    尿量(g)16.8±1.357.8±5.854.1±8.457.6±9.057.2±5.2
    血糖(mmol/L)5.48±0.2619.27±1.4820.35±0.9520.75±0.5120.03±0.29
    t10.8514.6511.4726.0525.87
    P10.441<0.001<0.001<0.001<0.001
    t20.266.8716.727.707.01
    P20.8060.002<0.0010.0020.002
    t30.839.837.146.4311.10
    P30.456<0.0010.0020.003<0.001
    t40.8615.9323.8149.6966.47
    P40.438<0.001<0.001<0.001<0.001
    注:糖尿病组大鼠注射链脲佐菌素构建糖尿病模型,对照组大鼠注射柠檬酸钠缓冲液;体重、饮水量、尿量、血糖时间因素主效应,F值分别为5.03、19.55、18.00、148.80,P值分别为0.059、<0.001、<0.001、<0.001;处理因素主效应,F值分别为367.40、589.00、493.60、4 582.00,P值均<0.001;两者交互作用,F值分别为143.00、14.20、15.51、147.20,P值均<0.001;t1值、P1值,t2值、P2值,t3值、P3值,t4值、P4值分别为2组各时间点体重、饮水量、尿量、血糖比较所得
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    术后14 d,对照组大鼠创面基本愈合,糖尿病组大鼠部分创面尚未愈合;糖尿病组大鼠创面愈合率为(68.3±2.8)%,显著低于对照组的(98.1±1.2)%(t=16.92,P<0.001)。

    术后14 d,对照组大鼠创面基本被新生上皮覆盖,创面组织内Fb排列紧密,胶原纤维丰富、排列有序;糖尿病组大鼠创面上皮大片缺如,创面组织内Fb排列紊乱,胶原纤维稀疏、排列杂乱。见图1

    图  1  2组大鼠术后各时间点全层皮肤缺损创面愈合情况及组织病理学情况。1A、1B.分别为对照组术后0(即刻)、14 d创面情况,图1B中创面基本愈合;1C、1D.分别为糖尿病组术后0、14 d创面情况,图1D中仍有较大面积创面未愈合;1E、1F.分别为对照组、糖尿病组术后14 d创面上皮化情况,图1E中创面基本被新生上皮覆盖,图1F中创面尚未完全被新生上皮覆盖 苏木精-伊红×20;1G、1H.分别为对照组、糖尿病组术后14 d创面组织中胶原纤维形成和排列情况,图1G中胶原纤维丰富、排列有序,图1H中胶原纤维稀疏、排列杂乱 Masson×20
    注:糖尿病组大鼠诱导糖尿病后通过外科手术制备创面,对照组大鼠仅同前制备创面;红色箭头表示新生上皮,胶原纤维阳性染色为蓝色

    术后14 d,与对照组相比,糖尿病组大鼠创面组织中三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle,TAC)过程中的顺乌头酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADP)、5'-鸟苷二磷酸(5'-guanosine diphosphate,GDP)表达量均显著升高(P<0.05),L-苹果酸表达量显著降低(P<0.05);糖酵解途径中的乳酸表达量显著降低(P<0.05);另外21种能量代谢物表达量变化不明显(P>0.05)。见表2

    Table  2.  2组大鼠术后14 d全层皮肤缺损创面组织中检测出的能量代谢物的表达量比较(μmol/g,x¯±s
    组别样本数乳酸顺乌头酸5'-鸟苷二磷酸L-苹果酸NADP硫胺素焦磷酸5'-腺苷三磷酸5'-腺苷二磷酸
    对照组319 383±87620.1±2.12.115±0.027225±159.9±2.63.73±0.3915.3±1.95.12±0.22
    糖尿病组310 261±95326.4±0.82.659±0.235194±514.5±0.54.32±0.2818.1±1.35.75±0.50
    t12.204.743.993.453.092.112.101.98
    P<0.0010.0090.0160.0260.0370.1030.1030.119
    注:糖尿病组大鼠诱导糖尿病后通过外科手术制备创面,对照组大鼠仅同前制备创面;NADP为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,NAD为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,PEP为磷酸烯醇式丙酮酸
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    5种差异能量代谢物主要在胰高血糖素、Rap1、Ras、缺氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor 1, HIF-1)信号通路及TAC、丙酮酸代谢、线粒体自噬、胞吞作用途径中显著富集,见图2。其中线粒体自噬、胞吞作用途径及Rap1、Ras信号通路主要有GDP富集,丙酮酸代谢途径、胰高血糖素信号通路主要有L-苹果酸和乳酸富集,TAC途径主要有顺乌头酸、L-苹果酸富集,HIF-1信号通路主要有乳酸富集。

    图  2  2组大鼠术后14 d全层皮肤缺损创面组织中5种差异能量代谢物的京都基因与基因组百科全书富集分析结果
    注:糖尿病组大鼠诱导糖尿病后通过外科手术制备创面,对照组大鼠仅同前制备创面;HIF-1为缺氧诱导因子1

    研究表明,糖尿病会影响大鼠创面愈合[5]。本研究构建了糖尿病大鼠创面模型,结果显示糖尿病组大鼠创面愈合速度较对照组明显减慢,这与先前的结论[6]一致。组织病理学检测结果显示,糖尿病组大鼠创面组织中Fb排列紊乱、胶原纤维数量减少且排列杂乱,这些都是导致创面愈合困难的重要因素。研究显示,在糖尿病小鼠及恒河猴等动物模型中存在显著的能量代谢障碍[7],能量代谢受损会导致创面愈合困难[8, 9]。于是本研究进行能量代谢组学检测,筛选出了糖尿病组大鼠较对照组大鼠创面组织中有明显变化的5种能量代谢物:乳酸、L-苹果酸、顺乌头酸、5'-鸟苷二磷酸、NADP。KEGG富集分析显示,这些差异能量代谢物在胰高血糖素、Rap1、Ras、HIF-1信号通路及TAC、丙酮酸代谢、线粒体自噬、胞吞作用途径中显著富集。

    乳酸是糖酵解的最终产物。KEGG富集分析显示,乳酸参与胰高血糖素、HIF-1信号通路及丙酮酸代谢途径。高强度运动导致的乳酸增加可以改善2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗,从而降低血糖[10]。糖尿病小鼠体内的高胰岛素水平会激活糖异生,从而增加乳酸的消耗[11]。乳酸减少通常提示丙酮酸代谢的紊乱,从而影响能量产生和线粒体功能[12]。乳酸减少也可影响细胞对缺氧的响应,干扰缺氧条件下HIF-1的活化,进而阻碍创面愈合过程中的血管生成和细胞增殖[13]。此外,乳酸还参与调节免疫细胞的清除过程[7],外源性乳酸的应用已被证实能够促进糖尿病小鼠创面组织中新生血管形成及创面再上皮化[14]。本研究结果显示,糖尿病组大鼠创面组织中乳酸表达量较对照组显著下降。然而,也有研究者在糖尿病患者足部溃疡渗出液中检测到较高的乳酸表达量[15]。糖尿病创面组织中乳酸表达量可能与创面愈合的阶段、感染是否存在以及糖尿病的基础治疗方法有关[16]

    L-苹果酸作为TAC的中间体,通过转化为异柠檬酸来促进循环进行[17]。本研究KEGG富集分析显示,L-苹果酸参与胰高血糖素信号通路及TAC、丙酮酸代谢途径等。有研究表明,L-苹果酸单体的降解产物通过进入线粒体并参与TAC来调节代谢微环境,从而提高细胞内ATP水平,促进Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白、α平滑肌肌动蛋白等ECM的合成,从而促进大鼠创面愈合[18]。L-苹果酸是一种天然有机酸,具有增强线粒体呼吸[19]、抗氧化[20]和增强羧酸盐代谢[21]等作用。L-苹果酸通过影响TAC途径、胰高血糖素信号通路及丙酮酸代谢途径调控葡萄糖水平[22, 23]。糖尿病大鼠的肝脏[24]以及1型糖尿病患者的周围神经[25]中L-苹果酸的表达量显著减少。外源性应用L-苹果酸铬复合物能够降低四氧嘧啶诱导的糖尿病大鼠血糖和血脂水平[26]。本研究结果显示,糖尿病大鼠创面组织中L-苹果酸的表达量较对照组明显降低,说明L-苹果酸的表达量降低可能是糖尿病创面愈合缓慢的原因之一。

    顺乌头酸在糖尿病创面愈合中的作用尚不清楚。本研究KEGG富集分析显示,顺乌头酸主要与TAC相关。顺乌头酸在线粒体中经过顺乌头酸脱羧酶1催化脱羧产生衣康酸(itaconic acid),衣康酸被认为是能量代谢中最突出的免疫代谢物[27],而糖尿病溃疡创面通常伴有细菌感染[28]。研究表明,衣康酸盐是在巨噬细胞内由顺乌头酸盐通过TAC生成的,以LPS为代表的多种激活因子会触发这一转化过程[29]。衣康酸在细菌感染中起着2种不同的作用。一方面,衣康酸具有很好的抗炎作用,可以抑制细菌(如金黄色葡萄球菌)生长[29, 30],促进巨噬细胞向M2型极化,促进糖尿病小鼠创面愈合[31];另一方面,衣康酸也可以诱导金黄色葡萄球菌等细菌出现耐受性[32, 33]。本研究检测到糖尿病大鼠创面组织中顺乌头酸的积累,这看似与其免疫代谢物衣康酸的抗炎功能相违背,但是糖尿病创面愈合过程远比想象的复杂。顺乌头酸的积聚一方面说明糖尿病导致皮肤组织细胞中线粒体功能受损;另一方面,在高血糖的条件下,衣康酸长期处于高水平导致细菌产生耐受性,创面环境中促炎-抗炎平衡紊乱,进一步恶化创面愈合微环境。

    GDP是鸟苷三磷酸(guanosine triphosphate,GTP)的直接前体,GTP在细胞内负责能量传递和信号转导。本研究KEGG富集分析显示,GDP与线粒体自噬、胞吞过程、Rap1及Ras信号通路相关。Rab蛋白是一类小GTP酶,参与细胞内的膜运输,与细胞内吞及自噬功能密切相关,而GDP与GTP的动态循环调节则直接影响Rab蛋白的活性[34, 35]。G蛋白偶联受体的信号转导在生物体的生命活动中占有重要地位,Ras与Rap1作为经典的G蛋白,在细胞内存在2种状态:一种是与GDP结合的非活性状态,另一种是与GTP结合的活性状态。当Ras、Rap1与GTP结合后,会激活下游的相关通路,促进细胞增殖和分化等过程。然而,在高血糖环境下,由于胰岛素抵抗的影响,GDP与GTP的转换过程会出现异常,导致GDP的累积,使更多的G蛋白保持非活性状态,无法有效传递信号[36]。本研究在糖尿病大鼠创面组织中检测到GDP的大量累积,GTP和GDP动态平衡被打破,这意味着创面组织中能量供应不足、G蛋白偶联信号转导受到干扰,影响包括胞吞在内的诸多信号转导过程。

    NADP亦被称为辅酶Ⅱ,是细胞能量代谢中不可或缺的关键成分,其还原形式还原型NADP(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)在多种合成代谢反应中发挥着重要作用,而葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是NADPH合成的关键酶之一。研究显示,在高血糖或存在糖尿病的情况下,大鼠肝脏、肾脏、脑组织和内皮细胞、红细胞等及人胰岛组织中的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性显著降低[37, 38, 39, 40]。这种活性降低导致NADPH的产生受阻,使细胞内NADP的表达量增加。因此,NADP的上调在一定程度上反映了糖尿病创面组织中抗氧化需求的增加[41]

    本研究分析了糖尿病大鼠创面组织的能量代谢特征,并取得了一些有意义的结果。检测到5种差异能量代谢物,这些差异能量代谢物的功能涉及能量调控、氧化应激和炎症反应等过程。其中,乳酸和L-苹果酸由于直接参与能量代谢和糖异生过程,对创面愈合的影响较大,因此在糖尿病创面的诊断和治疗中具有更显著的意义。顺乌头酸、GDP和NADP对糖尿病创面组织的能量代谢调控及创面修复也很重要,但它们的影响可能更为间接。

    本研究存在一些局限性,如每组仅有3个样本,这在一定程度上限制了研究的深度和广度,但是本研究通过检测大鼠模型的稳定性来尽可能地减少这一局限导致的结果偏倚。在后续的研究中,本研究团队将通过离体及在体实验进一步验证本研究结果的可靠性,更全面地探索糖尿病大鼠创面组织的能量代谢特征及其在创面愈合过程中的作用机制。

    尚亚鸽、张丽霞:实验操作与论文撰写;韩超、李梦洋:数据整理、统计学分析;罗亮、王许杰:研究指导、技术支持;胡大海:实验设计、论文修改、经费支持
    所有作者均声明不存在利益冲突
  • 参考文献(38)

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  • 图  1  小鼠毛乳头细胞的生长及标志物表达情况。1A.毛乳头组织培养7 d后,细胞呈短梭形,围绕组织块密集生长 倒置荧光显微镜×40;1B.成脂诱导培养2周后,细胞内可见脂滴(红色)形成 油红O×100;1C.成骨诱导培养3周后,细胞内可见钙结节(红色)形成 茜素红×100;1D.细胞中碱性磷酸酶(灰色)表达为阳性 对硝基苯磷酸二钠×40;1E、1F、1G、1H.分别为细胞中多能蛋白聚糖(红色)、CD133(红色)、β连环蛋白(绿色)及碱性磷酸酶(红色)表达情况,均为阳性 花青素3-异硫氰酸荧光素-4',6-二脒基-2-苯基吲哚×100

    图  2  2组全层皮肤缺损小鼠伤后各时间点创面愈合及毛发生长情况。2A、2B、2C.分别为PBS组伤后3、7、14 d创面形态,创面逐渐愈合,并可见新生毛发生长;2D、2E、2F.分别为DPC组伤后3、7、14 d创面形态,与图2A、2B、2C相比,图2D、2E、2F创面面积均更小,且图2F可见更多毛发生长

    注:分别于伤后2、4、6 d,通过创面周围皮下注射给予毛乳头细胞(DPC)组小鼠DPC、磷酸盐缓冲液(PBS)组小鼠PBS;各图中圆环为防止创面快速收缩的硅胶环

    图  3  2组全层皮肤缺损小鼠伤后14 d创面组织中新生毛囊及胶原沉积情况。3A、3B.分别为PBS组、DPC组新生毛囊情况,图3B中新生毛囊的数量明显多于图3A 苏木精-伊红×10;3C、3D.分别为PBS组、DPC组胶原沉积情况,图3C真皮层新生胶原的含量明显多于图3D Masson×10;3E、3F.分别为图3A、3B中方框中图形的放大图,图3E中无新生毛囊结构形成,而图3F中可见新生毛囊结构形成 苏木精-伊红×100;3G、3H.分别为图3C、3D中方框中图形的放大图,图3G中胶原排列致密、紊乱,图3H中胶原排列疏松 Masson ×100

    注:分别于伤后2、4、6 d,通过创面周围皮下注射给予毛乳头细胞(DPC)组小鼠DPC、磷酸盐缓冲液(PBS)组小鼠PBS

    图  4  2组全层皮肤缺损小鼠伤后14 d创面组织中β连环蛋白与Lef1的蛋白表达情况。4A、4B.分别为PBS组、DPC组β连环蛋白荧光表达情况,图4B中β连环蛋白荧光强度明显强于图4A Alexa Fluor 594-4',6-二脒基-2-苯基吲哚×100;4C、4D.分别为PBS组、DPC组Lef1荧光表达情况,图4D中Lef1荧光强度明显强于图4C Alexa Fluor 488-4',6-二脒基-2-苯基吲哚×100

    注:分别于伤后2、4、6 d,通过创面周围皮下注射给予毛乳头细胞(DPC)组小鼠DPC、磷酸盐缓冲液(PBS)组小鼠PBS;Lef1为淋巴增强结合因子1;Lef1阳性染色为绿色,β连环蛋白阳性染色为红色,细胞核阳性染色为蓝色

    图  5  蛋白质印迹法检测的2组全层皮肤缺损小鼠伤后14 d创面组织中β连环蛋白与Lef1的蛋白表达

    注:分别于伤后2、4、6 d,通过创面周围皮下注射给予毛乳头细胞(DPC)组小鼠DPC、磷酸盐缓冲液(PBS)组小鼠PBS;Lef1为淋巴增强结合因子1,GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶;条带上方1、2、3指示PBS组3个样本,4、5、6指示DPC组3个样本

    Table  1.   采用实时荧光定量反转录PCR法检测细胞因子mRNA表达的引物序列与产物大小

    引物名称引物序列(5'→3')产物大小(bp)
    β连环蛋白上游:GTGGTCATCGCCACCTTAATA101
    下游:TTCTCGCTGTTGGAGTTCAG
    淋巴增强结合因子1上游:TCTGCTGACATTTGCCTCTAC103
    下游:GCTGGTGGATGGCTCTTATATT
    3-磷酸甘油醛脱氢酶上游:GGTGAAGGTCGGTGTGAACG179
    下游:CTCGCTCCTGGAAGATGGTG
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