Interaction between fibroblasts and keratinocytes in the wound edge skin tissue of a diabetic foot patient and the mechanism
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摘要:
目的 探讨糖尿病足患者创缘皮肤组织中成纤维细胞（Fb）与角质形成细胞（KC）的相互作用及其机制。 方法 该研究为实验研究。取华中科技大学同济医学院附属梨园医院创面修复科2021年8月收治的1例糖尿病足患者（男,33岁）和该院手外科2021年9月收治的1例急性足外伤患者（男,50岁）创缘皮肤组织,行单细胞转录组测序,分析Fb亚群中趋化因子配体和KC亚群中趋化因子受体的相互作用。收集常规培养和用高浓度葡萄糖培养7 d的人包皮Fb（HFF）的上清液,分别作为正常条件培养基（CM）和高糖CM。取HaCaT细胞,分为用正常CM培养的正常CM组和用高糖CM培养的高糖CM组,进行划痕试验,并计算划痕后24、48 h细胞迁移率（样本数为3）。利用液相悬浮芯片检测2种CM中细胞因子含量（样本数为5）。取HFF,分为常规培养的正常组和用高浓度葡萄糖培养的高糖组,培养7 d,采用实时荧光定量反转录PCR法检测CXC趋化因子配体1（CXCL1）、CXCL2、CXCL8和CXCL12的mRNA表达（样本数为6）。取正常CM组和高糖CM组HaCaT细胞,采用蛋白质印迹法检测培养48 h细胞中CXC趋化因子受体4（CXCR4）的蛋白表达（样本数为3）。取HaCaT细胞,分为正常CM组、高糖CM组、正常CM+CXCL12组、高糖CM+CXCL12组,前2组细胞处理同前,后2组细胞分别采用含重组人CXCL12的正常CM和高糖CM培养,行划痕试验并计算划痕后24、48 h细胞迁移率,采用蛋白质印迹法检测培养48 h细胞中CXCR4蛋白表达（样本数均为3）。 结果 相较于急性足外伤创缘皮肤组织,糖尿病足创缘皮肤组织Fb亚群中的趋化因子配体（CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL8、CXCL12）和KC亚群中的趋化因子受体（CXCR2和CXCR4）间的相互作用明显减弱。划痕后24、48 h,高糖CM组HaCaT细胞迁移率均明显低于正常CM组（t值分别为23.50、15.65,P<0.05）。相较于正常CM,高糖CM中的CXCL1含量明显增多（P<0.05）,CXCL12含量明显减少（P<0.05）。培养7 d,相较于正常组,高糖组HFF中CXCL1、CXCL2和CXCL8的mRNA表达均明显升高（t值分别为4.25、4.98、10.04,P<0.05）,CXCL12的mRNA表达明显降低（t=4.10,P<0.05）。培养48 h,高糖CM组HaCaT细胞中CXCR4的蛋白表达明显低于正常CM组（t=5.13,P<0.05）。划痕后24、48 h,高糖CM组HaCaT细胞迁移率较正常CM组和高糖CM+CXCL12组明显降低（P值均<0.05）；划痕后24 h,正常CM+CXCL12组HaCaT细胞迁移率较正常CM组明显降低（P<0.05）；划痕后48 h,正常CM+CXCL12组HaCaT细胞迁移率较高糖CM+CXCL12组明显升高（P<0.05）。培养48 h,高糖CM+CXCL12组HaCaT细胞中CXCR4蛋白表达为0.446±0.050,明显高于高糖CM组的0.247±0.010（P<0.05）,与正常CM+CXCL12组的0.522±0.082相近（P>0.05）；正常CM组HaCaT细胞中CXCR4蛋白表达为0.509±0.055,明显高于高糖CM组（P<0.05）。 结论 糖尿病足创缘皮肤组织Fb亚群中的趋化因子配体和KC亚群中的趋化因子受体间的相互作用明显减弱。高糖抑制HFF分泌CXCL12,其细胞培养上清液刺激导致HaCaT细胞迁移能力减弱、CXCR4表达降低。给予外源性CXCL12蛋白可增加HaCaT细胞中CXCR4的蛋白表达,增强细胞迁移能力。 Abstract:Objective To investigate the interaction between fibroblasts (Fb) and keratinocytes (KC) in the wound edge skin tissue of a diabetic foot patient and the mechanism. Methods This was an experimental research. The wound edge skin tissue from a diabetic foot patient (male and 33 years old) admitted to the Department of Wound Repair of Liyuan Hospital Affiliated to Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology in August 2021 and from an acute foot injury patient (male and 50 years old) admitted to the Department of Hand Surgery of the hospital in September 2021 was collected. The single-cell transcriptome sequencing was performed to analyze the interaction between chemokine ligands of Fb subgroup and chemokine receptors of KC subgroup. The supernatant was collected after human foreskin fibroblast (HFF) was cultured routinely and with high concentration of glucose for 7 days as normal conditioned medium (CM) and high glucose CM, respectively. HaCaT cells were collected and divided into normal CM group cultured with normal CM and high glucose CM group cultured with high glucose CM, the scratch test was performed to calculate the cell migration rates at 24 and 48 h after scratch (n=3). The content of cytokines in the two kinds of CM was detected by liquid suspension chip (n=5). HFF was collected and divided into normal group cultured routinely and high glucose group cultured with high concentration of glucose for 7 days, and the mRNA expressions of C-X-C motif chemokine ligand 1 (CXCL1), CXCL2, CXCL8, and CXCL12 were detected by real-time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (n=6). HaCaT cells in normal CM group and high glucose CM group were collected to detect the protein expressions of C-X-C motif chemokine receptor 4 (CXCR4) in cells cultured for 48 h by Western blotting (n=3). HaCaT cells were collected and divided into normal CM group, high glucose CM group, normal CM+CXCL12 group, and high glucose CM+CXCL12 group. The first two groups of cells were treated as before, and the latter two groups of cells were cultured with normal CM and high glucose CM containing recombinant human CXCL12, respectively. Scratch test was performed, and cell migration rates were calculated at 24 and 48 h after scratch (n=3); the protein expression of CXCR4 in cells cultured for 48 h was detected by Western blotting (n=3). Results Compared with those in the wound edge skin tissue of acute foot injury, the interactions between chemokine ligands (CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL8, and CXCL12) of Fb subgroup and chemokine receptors (CXCR2 and CXCR4) of KC subgroup were significantly weakened in the wound edge skin tissue of diabetic foot. At 24 and 48 h after scratch, the migration rates of HaCaT cells in high glucose CM group were significantly lower than those in normal CM group (with t values of 23.50 and 15.65, respectively, P<0.05). Compared with that in normal CM, the content of CXCL1 in high glucose CM was significantly increased (P<0.05), and the content of CXCL12 was significantly decreased (P<0.05). After 7 days of culture, compared with those in normal group, the mRNA expressions of CXCL1, CXCL2, and CXCL8 in HFF in high glucose group were significantly increased (with t values of 4.25, 4.98, and 10.04, respectively, P<0.05), while the mRNA expression of CXCL12 was significantly decreased (t=4.10, P<0.05). After 48 h of culture, the CXCR4 protein expression in HaCaT cells in high glucose CM group was significantly lower than that in normal CM group (t= 5.13, P<0.05). At 24 and 48 h after scratch, the migration rates of HaCaT cells in high glucose CM group were significantly lower than those in normal CM group and high glucose CM+CXCL12 group (with P values all <0.05); at 24 h after scratch, the migration rate of HaCaT cells in normal CM+CXCL12 group was significantly lower than that in normal CM group (P<0.05); at 48 h after scratch, the migration rate of HaCaT cells in normal CM+CXCL12 group was significantly higher than that in high glucose CM+CXCL12 group (P<0.05). At 48 h of culture, the CXCR4 protein expression of HaCaT cells in high glucose CM+CXCL12 group was 0.446±0.050, which was significantly higher than 0.247±0.010 in high glucose CM group (P<0.05) and similar to 0.522±0.082 in normal CM+CXCL12 group (P>0.05); the CXCR4 protein expression in HaCaT cells in normal CM group was 0.509±0.055, which was significantly higher than that in high glucose CM group (P<0.05). Conclusions The interactions between chemokine ligands of Fb subgroup and chemokine receptors of KC subgroup were significantly weakened in the wound edge skin tissue of diabetic foot. High glucose can inhibit CXCL12 secretion of HFF, and the stimulation of its cell culture supernatant can decrease HaCaT cell migration ability and CXCR4 expression. Exogenous CXCL12 protein can increase the CXCR4 protein expression in HaCaT cells and enhance the cell migration ability. -
Key words:
- Cell communication /
- Chemokines, CXC /
- Receptors, chemokine /
- Fibroblasts /
- Keratinocytes /
- Cell migration /
- Wound repair
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(1)回顾分析显示，脉冲染料激光动态联合曲安奈德治疗瘢痕疙瘩可较单纯曲安奈德注射治疗缩短显效时间，减少曲安奈德注射次数，增加随访次数，提高患者依从性。
(2)通过与单纯曲安奈德注射治疗效果对比，为脉冲染料激光动态联合曲安奈德治疗瘢痕疙瘩的临床深入应用提供了参考依据。
瘢痕疙瘩是一种特殊的病理性瘢痕，不仅影响患者外观及功能，还对患者生活造成影响［1, 2］。目前瘢痕疙瘩治疗方法众多［3］，但单一治疗方式往往难以达到满意的疗效，个体化、综合性动态治疗已成为瘢痕疙瘩治疗的趋势［4, 5］。糖皮质激素类药物瘢痕内局部注射是瘢痕疙瘩综合性治疗的常用方法，曲安奈德则是使用最广泛的糖皮质类激素［6］。但单独注射糖皮质激素治疗瘢痕疙瘩的耗时较长，不良反应较多，且愈后瘢痕疙瘩的复发率较高［5］。近年来的研究表明，糖皮质激素类药物瘢痕内注射联合激光治疗模式，可提高治疗效果并减少不良反应［7］。目前，脉冲染料激光（PDL）已成为瘢痕疙瘩综合性治疗中的主要激光之一［8］。不同于皮肤血管性疾患，瘢痕疙瘩具有自身特殊性，如质地较硬且厚等；采用PDL治疗瘢痕疙瘩可能难以达到治疗深度而影响治疗效果，且不恰当的治疗时机以及过激的照射可能激发炎症反应反而加重病情。因此，PDL在瘢痕疙瘩综合动态治疗中的临床应用及疗效尚需进一步探索。本研究拟通过分析PDL动态联合曲安奈德在非手术瘢痕疙瘩患者治疗中的应用效果，探讨该动态疗法在瘢痕疙瘩的个体化综合治疗方案中的有效性。
1. 对象与方法
本回顾性观察性研究符合《赫尔辛基宣言》的基本原则。根据河南大学淮河医院伦理委员会的相关规定，可以在不泄露患者身份的前提下分析、使用相关临床资料。
1.1 入选标准
纳入标准：（1）接受非手术治疗的瘢痕疙瘩患者；（2）随访时间≥1年，临床资料数据完整的患者；（3）至少进行过1次PDL+曲安奈德联合治疗或者单纯曲安奈德注射治疗。排除标准：（1）免疫缺陷患者或6个月内接受过其他治疗患者；（2）合并心脏病、糖尿病等原发性基础性疾病患者。
1.2 临床资料与分组
2015年4月—2020年10月，河南大学淮河医院收治34例符合入选标准的瘢痕疙瘩患者，共46处瘢痕疙瘩，瘢痕疙瘩病程为2~240个月。根据采用的治疗方式，将患者分为曲安奈德组（18例）与动态治疗组（16例），前一组患者中男8例、女10例，年龄（30±12）岁，与后一组患者中男6例、女10例的性别分布（P=0.738）及（26±11）岁的年龄（t=0.89，P=0.382）相近。曲安奈德组、动态治疗组患者瘢痕疙瘩数分别为26、20个，病程分别为36.0（24.0，51.0）、42.0（19.5，120.0）个月（Z=-0.64，P=0.524），初诊体积分别为0.52（0.20，1.53）、0.66（0.17，1.54）cm3（Z=-0.06，P=0.956）；曲安奈德组患者瘢痕疙瘩分布在前胸（11个）与肩背、耳、下颌（各3个）以及颈、腹、四肢（各2个），与动态治疗组患者前胸（13个）、肩背（3个）、耳（2个）及颈与会阴（各1个）的部位分布相近（χ2=7.08，P=0.424）；曲安奈德组患者瘢痕疙瘩随访时间为26.0（15.0，37.8）个月，明显长于动态治疗组的15.0（12.0，24.5）个月（Z=-2.78，P=0.005）。
1.3 治疗方法
（1）曲安奈德组：将5 mL质量浓度为10 mg/mL的曲安奈德与5 mL质量浓度为20 g/L的利多卡因混合配制成注射混合液，根据瘢痕大小选择适当的注射范围。采用多点分层注射法，尽可能覆盖患处。边退针边注射，至瘢痕组织苍白充盈为止，注射量为2 mg/cm2，每次注射总量不高于40 mg。建议该组患者1个月治疗1次并行治疗前温哥华瘢痕量表（VSS）评分。（2）动态治疗组：每次治疗前，采用VSS评估瘢痕情况，据此选择治疗方式。若仅厚度和/或柔软度>2分，则仅同前给予曲安奈德注射治疗；若仅色泽和/或血管分布>2分，则仅给予PDL治疗；若厚度和/或柔软度>2分且色泽和/或血管分布>2分，则给予PDL+曲安奈德联合治疗［9］；若厚度、柔软度、色泽、血管分布各项评分均<2分，则不进行治疗。PDL治疗中使用595 nm PDL治疗仪，选择光斑直径7 mm、脉冲宽度1.5~30.0 ms、能量密度8.5~13.5 J/cm2，以出现轻度紫癜为治疗终点。PDL+曲安奈德联合治疗中先进行同前PDL治疗后，即刻冷敷30 min，之后继续行前述曲安奈德注射治疗。建议该组患者每个月就诊接受评估。
1.4 评估指标
1.4.1 瘢痕疙瘩评分
首次治疗前及首次治疗后（以下简称治疗前与治疗后）12个月，由2名未参与治疗的河南大学淮河医院整形修复外科医师使用同一台数码相机拍摄患者瘢痕疙瘩照片，并采用VSS、患者与观察者瘢痕评估量表（POSAS）评估瘢痕疙瘩情况［10］。VSS包含厚度、柔软度、色泽、血管分布条目，总分为0~15分［11］；POSAS包含观察者量表和患者量表，观察者量表包括血管分布、色泽、厚度、表面粗糙度、柔软度和表面积条目，患者量表包括疼痛程度、瘙痒程度、颜色、硬度、厚度及自我感受条目，总分为12~120分［10］。结果记录总评分及各量表中色泽和血管分布总分。总分越低越好。
1.4.2 生活质量评分
同1.4.1中时间，由1.4.1中医师采用皮肤病生活质量指数（DLQI）量表评估瘢痕疙瘩对患者生活质量的影响情况。DLQI量表共有10个问题，包括症状感受、日常活动、休闲娱乐、工作学习、人际关系及治疗维度，总分为0~30分［12］。总分越低越好。
1.4.3 疗效评价
治疗后12个月，依据VSS评分进行瘢痕疙瘩疗效评价并计算显效率。VSS总评分11~15分为无效，6~10分为好转，1~5分为显效，0分为痊愈［13］；显效率=（显效瘢痕疙瘩数+痊愈瘢痕疙瘩数）÷瘢痕疙瘩总数×100%。
1.4.4 首次显效时间及达到首次显效时曲安奈德累计注射次数
记录瘢痕疙瘩首次达到显效所花的治疗时间、从治疗开始至首次达到显效期间所注射的曲安奈德次数。
1.4.5 随访次数及不良反应
记录瘢痕疙瘩治疗后12个月内随访次数（以此体现患者依从性）与不良反应发生情况并计算不良反应发生率。PDL治疗后可能出现水疱、紫癜、色素沉着等不良反应，曲安奈德治疗后可能出现皮质醇增多症、毛细血管扩张、局部凹陷、色素沉着或脱失、药物沉渣等不良反应。同一个瘢痕疙瘩多次发生同一种不良反应只计1次。不良反应发生率=不良反应发生次数÷瘢痕疙瘩总数×100%。
1.5 统计学处理
采用SPSS 24.0统计软件进行数据分析。计量资料数据中符合正态分布者用
2. 结果
2.1 瘢痕疙瘩评分
曲安奈德组、动态治疗组患者瘢痕疙瘩治疗后12个月的VSS总评分均较治疗前明显降低（t值分别为7.53、8.09，P<0.001），VSS、POSAS中色泽和血管分布总分与POSAS总评分均较治疗前明显降低（Z值分别为-3.71、-4.04、-4.21，-3.76、-3.73、-3.92，P<0.001）。2组患者瘢痕疙瘩治疗前、治疗后12个月的VSS、POSAS总评分以及治疗前VSS、POSAS中色泽和血管分布总分均相近（P>0.05），动态治疗组患者治疗后12个月瘢痕疙瘩的VSS、POSAS中色泽和血管分布总分均明显低于曲安奈德组（P<0.05）。见表1。
表1 2组瘢痕疙瘩患者首次治疗前后瘢痕疙瘩评分比较（分）组别 瘢痕疙瘩数（个） VSS总评分（ VSS中色泽和血管分布总分［M（Q1，Q3）］ POSAS总评分［M（Q1，Q3）］ POSAS中色泽和血管分布总分［M（Q1，Q3）］ 治疗前 治疗后12个月 治疗前 治疗后12个月 治疗前 治疗后12个月 治疗前 治疗后12个月 曲安奈德组 26 9.1±1.2 5.3±2.7a 4.00（4.00，4.25） 3.00（1.00，3.25）a 60.5（54.0，65.0） 37.0（22.5，52.8）a 14.0（13.0，17.0） 11.0（6.8，12.5）a 动态治疗组 20 9.4±1.7 4.8±2.7a 4.00（4.00，5.00） 1.00（1.00，2.00）a 60.5（49.5，80.0） 30.0（22.8，38.8）a 14.0（14.0，16.8） 6.0（3.5，9.0）a 统计量值 t=-0.55 t=0.54 Z=-0.07 Z=-2.03 Z=-0.52 Z=-0.37 Z=-0.17 Z=-2.12 P值 0.587 0.593 0.941 0.042 0.602 0.593 0.866 0.034 注：动态治疗组疗法包括行曲安奈德注射、脉冲染料激光（PDL）或者PDL联合曲安奈德注射治疗；VSS为温哥华瘢痕量表，POSAS为患者与观察者瘢痕评估量表；与治疗前比较，aP<0.01 2.2 生活质量评分
曲安奈德组、动态治疗组患者瘢痕疙瘩治疗后12个月DLQI量表评分分别为4.0（0，10.0）、3.0（2.0，6.8）分，均明显低于治疗前的12.0（8.0，13.0）和10.0（9.0，11.0）分（Z值分别为-4.11、-3.93，P<0.001）。2组患者治疗前、治疗后12个月DLQI量表评分均相近（Z值分别为-1.02、-0.09，P值分别为0.309、0.930）。
2.3 疗效评价
治疗后12个月，曲安奈德组患者瘢痕疙瘩达到显效者12个（46.15%）、好转者12个（46.15%）、无效者2个（7.70%），显效率为46.15%（12/26）；动态治疗组患者瘢痕疙瘩达到痊愈者2个（10.00%）、显效者13个（65.00%）、好转者4个（20.00%）、无效者1个（5.00%），显效率为75.00%（15/20），明显高于曲安奈德组（Z=3.88，P=0.047）。
2.4 首次显效时间及达到首次显效时曲安奈德累计注射次数
动态治疗组患者瘢痕疙瘩首次显效时间为5.5（2.0，6.0）个月，明显短于曲安奈德组的6.0（2.3，10.3）个月（Z=4.02，P=0.045）。动态治疗组患者瘢痕疙瘩达到首次显效时曲安奈德累计注射次数为（3.2±1.7）次，明显少于曲安奈德组的（4.2±1.8）次（t=2.09，P=0.043）。
2.5 随访次数及不良反应
动态治疗组患者瘢痕疙瘩治疗后12个月内随访次数为（6.5±2.1）次，明显多于曲安奈德组的（5.0±1.4）次（t=-2.94，P=0.005）。
治疗后12个月内，2组患者均未出现皮质醇增多症等全身性不良反应，动态治疗组患者激光治疗后未出现水疱等不良反应。动态治疗组患者瘢痕疙瘩治疗后12个月内5种不良反应发生率及总不良反应发生率均低于曲安奈德组，但差异均无统计学意义（P>0.05）。见表2。
表2 2组瘢痕疙瘩患者首次治疗后12个月内不良反应发生情况[次（%）]组别 瘢痕疙瘩数（个） 毛细血管扩张 色素沉着 局部凹陷 药物沉渣 色素脱失 总不良反应 曲安奈德组 26 7（26.92） 4（15.38） 2（7.69） 2（7.69） 2（7.69） 17（65.38） 动态治疗组 20 2（10.00） 2（10.00） 1（5.00） 1（5.00） 1（5.00） 7（35.00） P值 0.262 0.684 >0.999 >0.999 >0.999 0.073 注：动态治疗组疗法包括行曲安奈德注射、脉冲染料激光（PDL）或者PDL联合曲安奈德注射治疗 2.6 典型病例
例1
女，33岁，前胸部表面皮肤毛囊炎后形成瘢痕疙瘩14年余，瘢痕疙瘩体积约为2.40 cm3，偶伴瘙痒、疼痛等症状，因采用的治疗方式被纳入动态治疗组。治疗前VSS、POSAS总评分分别为10、64分，VSS、POSAS中色泽和血管分布总分分别为4、13分，DLQI评分10分，行PDL联合曲安奈德注射治疗。治疗后1个月，瘢痕疙瘩质地有所软化，厚度变薄，基本平整，颜色得到改善，VSS总评分为6分，继续进行前述联合治疗。治疗后2个月，瘢痕疙瘩平整，质地柔软，颜色改善，VSS总评分为3分，此时首次达到显效（累计注射2次曲安奈德）。治疗后3~5个月随访未治疗，至治疗后6个月，瘢痕疙瘩稍突出皮面，色泽加深伴血管增生，VSS总评分为5分，再次给予联合治疗。之后随访（治疗后7、9个月未随访），至治疗后12个月，瘢痕疙瘩趋于平稳，VSS、POSAS总评分分别为4、20分，VSS、POSAS中色泽和血管分布总分分别为2、5分，DLQI评分4分；治疗后12个月内，随访10次，未发生不良反应。治疗后24个月，VSS总评分为4分，瘢痕疙瘩趋于平稳，未见复发迹象。见图1。
1 例1动态治疗组患者前胸部表面皮肤毛囊炎后形成瘢痕疙瘩首次治疗前后情况。1A.治疗前，瘢痕疙瘩明显高于体表，充血明显；1B.行脉冲染料激光联合曲安奈德注射治疗后1个月，瘢痕疙瘩厚度变薄，颜色得到改善；1C.治疗后2个月，瘢痕疙瘩平整，颜色改善，达到显效例2
女，45岁，不明原因导致肩背部形成瘢痕疙瘩10年余，瘢痕疙瘩体积约为10.18 cm3，偶伴瘙痒，无疼痛等症状，因采用的治疗方式被纳入曲安奈德组。治疗前VSS、POSAS总评分分别为11、71分，VSS、POSAS中色泽和血管分布总分分别为5、14分，DLQI评分13分，患者拒绝激光治疗，仅接受局部曲安奈德注射治疗。治疗后1个月，瘢痕疙瘩颜色加深，厚度变厚，硬度变硬，VSS总评分为12分，继续给予注射治疗。治疗后2~7个月，瘢痕疙瘩逐渐趋于平整，质地逐渐变软，颜色逐渐改善，但VSS总评分均>5分，在此期间继续每个月给予1次曲安奈德注射治疗。治疗后8、9个月未随访。治疗后10个月，瘢痕疙瘩变平整，质地软，颜色变淡，VSS总评分为5分，此时首次达到显效（累计注射7次曲安奈德）。治疗后11个月随访未治疗，至治疗后12个月，瘢痕疙瘩趋于平稳，未见复发迹象，VSS、POSAS总评分分别为5、26分，VSS、POSAS中色泽和血管分布总分分别为2、5分，DLQI评分5分；治疗后12个月内，随访10次，出现毛细血管扩张不良反应。治疗后24个月，瘢痕疙瘩突出皮面，VSS总评分为7分，再次给予曲安奈德注射治疗。之后几个月随访未治疗，至治疗后27个月，VSS总评分为4分，瘢痕疙瘩趋于平稳，未见复发迹象。见图2。
2 例2曲安奈德组患者肩背部不明原因所致瘢痕疙瘩首次治疗前后情况。2A.治疗前，瘢痕疙瘩明显高出体表，色泽较深；2B.行曲安奈德注射治疗后1个月，瘢痕疙瘩色泽加深，厚度变厚；2C.治疗后2个月，瘢痕疙瘩稍平整，颜色改善；2D.治疗后7个月，瘢痕疙瘩颜色改善；2E.治疗后10个月，瘢痕疙瘩变平整，颜色淡，达到显效3. 讨论
瘢痕疙瘩是一种纤维化疾病［14］，全球发生率为0.09%~16%［15］，其临床特征为超出原始损伤范围，突出皮肤表面，呈侵袭性生长且无自发消退性［16］。90%瘢痕疙瘩组织中存在线性并且相对平行于皮肤表面的血管结构［17］。瘢痕疙瘩组织中持续存在增多的微血管、Fb及炎症细胞［18］，且由边缘到中心区域逐渐减少，提示瘢痕疙瘩组织内持续存在炎症反应［19］。曲安奈德是目前最为常用的瘢痕疙瘩局部注射药物，其作用机制主要是干扰炎症细胞的迁移与吞噬，并通过抑制血管再形成，造成瘢痕疙瘩区域营养供给障碍［20］。Ogawa和Akaishi［19］认为，在创面愈合的炎症反应阶段，局部因素（如高张力、遗传因素等）导致血管内皮细胞功能障碍，致使血管通透性增高，进而加速炎症细胞及炎症因子聚集，最终使Fb聚集，ECM增多。因此，在瘢痕疙瘩的炎症反应期局部注射曲安奈德可有效抑制局部炎症反应，减少胶原合成及ECM沉积。但糖皮质激素产生的全身性及局部不良反应不容忽视，这也限制了其应用。
近年来，PDL越来越多地被应用于瘢痕疙瘩治疗中［5，21, 22］，其治疗瘢痕疙瘩的效果亦逐渐被认可，相关机制主要有以下几个方面：（1）PDL可被血管中血红蛋白选择性吸收，从而引起血管受热闭塞［23, 24］。（2）PDL可促使G0/G1期的细胞比例升高，抑制组织中Fb增殖，减少ECM沉积［25］；（3）PDL可降低TGF-β1分泌量，增加TGF-β3分泌量，进而抑制胶原生成［26, 27］。PDL治疗瘢痕疙瘩不仅效果显著，且能有效减少激素注射后的不良反应［5］。因局部激素注射后，组织内压增加，毛细血管不充盈，无法特异性吸收激光能量，因此有学者研究提出PDL治疗后联合曲安奈德注射治疗的模式［28］。Blanco de Tord等［21］治疗1例难治性耳郭瘢痕疙瘩患者时，应用PDL治疗后局部注射0.5 mL曲安奈德，6个月后疗效显著且未见复发。本研究中，根据首次显效时间及达到首次显效时曲安奈德累计注射次数的对比分析可见，相对于单纯曲安奈德治疗，PDL动态联合曲安奈德治疗可缩短瘢痕疙瘩治疗时间，减少激素注射次数。VSS、POSAS中色泽和血管分布总分统计结果显示，动态治疗优于单纯曲安奈德治疗，提示PDL可能是通过对局部血管的治疗作用而提高瘢痕疙瘩的临床疗效的。这与Khattab等［22］的研究结果一致，其研究结果表明，PDL联合局部注射维拉帕米较单独注射维拉帕米治疗瘢痕疙瘩，可显著减少局部血管分布。
瘢痕的发生发展是一个渐进和长期的病理过程，需要对其进行持续、充分的治疗。易复发性是瘢痕疙瘩的特点，瘢痕疙瘩的综合动态治疗是目前的趋势，而定期随访、动态评估、及时干预是综合动态治疗的核心［9］。本研究中采用动态治疗模式，根据VSS评估结果及瘢痕疙瘩临床症状制订不同的随访及治疗计划。与传统PDL+曲安奈德联合治疗模式［21，29］相比，本研究中的动态治疗模式根据患者实际病情，决定其治疗内容，避免了因不恰当时机的激光照射刺激而加重临床症状的发生。Muneuchi等［30］采用曲安奈德注射治疗94例瘢痕疙瘩患者，治疗间隔≥4周，结果显示31例患者在10次注射治疗内放弃治疗，原因是患者难以忍受注射时的疼痛，以及在短期内没有看到明显疗效。本研究结果显示，接受动态治疗的患者依从性高于仅接受曲安奈德注射治疗的患者；且本课题组临床研究显示仅接受曲安奈德注射治疗患者的放弃治疗率为43.75%（14/32），高于动态治疗组的20.00%（4/20），另文发表。这可能与接受动态治疗的患者曲安奈德注射次数减少从而减轻了注射痛苦，短时间治疗有明显的症状改善增加了患者信心，使得患者更易接受治疗有关。患者依从性提高可使随访率增高，便于及时评估病情选择适当治疗方式，进一步提高患者临床疗效，从而达到良性循环。本研究结果提示了PDL动态联合曲安奈德注射治疗在综合性动态治疗中的优势。
本研究纳入的瘢痕疙瘩患者在接受不同方式治疗后，均未出现全身性不良反应如皮质醇增多症等。动态治疗组患者的5种不良反应、总不良反应发生率低于曲安奈德组，其原因可能与接受动态治疗的患者曲安奈德注射次数减少、曲安奈德注射总量减少有关。动态治疗组患者瘢痕疙瘩毛细血管扩张的发生率亦低于曲安奈德组，且此并发症可通过PDL治疗得以改善，提示了PDL动态联合曲安奈德治疗的优势。然而该不良反应结果缺乏统计学意义，可能与本研究样本量较少有关，尚需进一步研究验证。
综上所述，与单纯曲安奈德注射治疗比较，PDL动态联合曲安奈德治疗瘢痕疙瘩可减少曲安奈德注射次数，缩短疗程，提高患者依从性，进而提高瘢痕疙瘩治疗效果。然而本研究是基于现有样本量的回顾性研究，样本量较少，结果存在一定的局限性，且动态治疗中2种疗法如何相互作用尚不明确，还需要进一步研究。未来，本研究团队拟加大样本量并且以更加客观的指标对疗效进行评价，以提高研究结果的准确性。
阮琼芳：实验设计与实施、文章起草、获取研究经费；章思语：实验实施；席毛毛：数据整理与统计分析；阮晶晶：数据收集与材料支持；李炳辉：临床病例资料收集；刘淑华、谢卫国：对文章的知识性内容做批评性审阅所有作者均声明不存在利益冲突 -
参考文献
(35) [1] McDermottK,FangM,BoultonA,et al.Etiology, epidemiology, and disparities in the burden of diabetic foot ulcers[J].Diabetes Care,2023,46(1):209-221.DOI: 10.2337/dci22-0043. [2] LanT,LiZ,ChenJ.FusionSegNet: fusing global foot features and local wound features to diagnose diabetic foot[J].Comput Biol Med,2023,152:106456.DOI: 10.1016/j.compbiomed.2022.106456. [3] PatelS,SrivastavaS,SinghMR,et al.Mechanistic insight into diabetic wounds: pathogenesis, molecular targets and treatment strategies to pace wound healing[J].Biomed Pharmacother,2019,112:108615.DOI: 10.1016/j.biopha.2019.108615. [4] 曹涛,肖丹,计鹏,等.肝细胞生长因子修饰的人脂肪间充质干细胞外泌体对糖尿病小鼠全层皮肤缺损的作用[J].中华烧伤与创面修复杂志,2022,38(11):1004-1013.DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20220731-00330. [5] 王宁,鞠上.糖尿病足溃疡难愈合机制研究进展[J].中华烧伤与创面修复杂志,2022,38(11):1085-1089.DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20220227-00038. [6] SorgH, SorgCGG. Skin wound healing: of players, patterns, and processes[J]. Eur Surg Res, 2023,64(2):141-157. DOI: 10.1159/000528271. [7] 谢军,毛玉洁,王思宇,等.紫草素对大鼠慢性皮肤溃疡创面愈合及新生血管形成的促进作用及其机制[J].解放军医学杂志,2022,47(1):39-45.DOI: 10.11855/j.issn.0577-7402.2022.01.0039. [8] OrmazabalV,Nova-LampetiE,RojasD,et al.Secretome from human mesenchymal stem cells-derived endothelial cells promotes wound healing in a type-2 diabetes mouse model[J].Int J Mol Sci,2022,23(2):941.DOI: 10.3390/ijms23020941. [9] SharifiaghdamM, ShaabaniE, Faridi-MajidiR, et al. Macrophages as a therapeutic target to promote diabetic wound healing[J]. Mol Ther,2022,30(9):2891-2908. DOI: 10.1016/j.ymthe.2022.07.016. [10] LuD,XuY,LiuQ,et al.Mesenchymal stem cell-macrophage crosstalk and maintenance of inflammatory microenvironment homeostasis[J].Front Cell Dev Biol,2021,9:681171.DOI: 10.3389/fcell.2021.681171. [11] DiX,ChenJ,LiY,et al.Crosstalk between fibroblasts and immunocytes in fibrosis: from molecular mechanisms to clinical trials[J].Clin Transl Med,2024,14(1):e1545.DOI: 10.1002/ctm2.1545. [12] ChabeliMS,WangX,YinghaoL,et al.Similarities between wound re-epithelialization and metastasis in ESCC and the crucial involvement of macrophages: a review[J].Cancer Treat Res Commun,2022,32:100621.DOI: 10.1016/j.ctarc.2022.100621. [13] MaZ,DingY,DingX,et al.PDK4 rescues high-glucose-induced senescent fibroblasts and promotes diabetic wound healing through enhancing glycolysis and regulating YAP and JNK pathway[J].Cell Death Discov,2023,9(1):424.DOI: 10.1038/s41420-023-01725-2. [14] ZhangS,MengN,LiuS,et al.Targeting senescent HDF with the USP7 inhibitor P5091 to enhance DFU wound healing through the p53 pathway[J].Biochem Biophys Res Commun,2024,722:150149.DOI: 10.1016/j.bbrc.2024.150149. [15] VozaFA,HuertaCT,LeN,et al.Fibroblasts in diabetic foot ulcers[J].Int J Mol Sci,2024,25(4):2172. DOI: 10.3390/ijms25042172. [16] LiuY,LiuY,HeW,et al.Fibroblasts: immunomodulatory factors in refractory diabetic wound healing[J].Front Immunol,2022,13:918223.DOI: 10.3389/fimmu.2022.918223. [17] 何秀娟,林燕,刘青武,等.皮肤成纤维细胞在创面愈合中的研究进展[J/CD].中华损伤与修复杂志(电子版),2021,16(1):74-77.DOI: 10.3877/cma.j.issn.1673-9450.2021.01.015. [18] XiaoY,QianJ,DengX,et al.Macrophages regulate healing-associated fibroblasts in diabetic wound[J].Mol Biol Rep,2024,51(1):203.DOI: 10.1007/s11033-023-09100-1. [19] HeS,LiZ,WangL,et al.A nanoenzyme-modified hydrogel targets macrophage reprogramming-angiogenesis crosstalk to boost diabetic wound repair[J].Bioact Mater,2024,35:17-30.DOI: 10.1016/j.bioactmat.2024.01.005. [20] HollJ,KowalewskiC,ZimekZ,et al.Chronic diabetic wounds and their treatment with skin substitutes[J].Cells,2021,10(3):655.DOI: 10.3390/cells10030655. [21] WilkinsonHN,HardmanMJ.Wound healing: cellular mechanisms and pathological outcomes[J].Open Biol,2020,10(9):200223.DOI: 10.1098/rsob.200223. [22] GrzelakEM,ElshanNGRD,ShaoS,et al.Pharmacological YAP activation promotes regenerative repair of cutaneous wounds[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2023,120(28):e2305085120.DOI: 10.1073/pnas.2305085120. [23] JohnJV,SharmaNS,TangG,et al.Nanofiber aerogels with precision macrochannels and LL-37-mimic peptides synergistically promote diabetic wound healing[J].Adv Funct Mater,2023,33(1):2206936. DOI: 10.1002/adfm.202206936. [24] 张喻平,张琼,邓芳,等.高糖微环境下P62对人表皮细胞株HaCaT迁移和运动性的影响及其机制[J].中华烧伤与创面修复杂志,2022,38(11):1014-1022.DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20220630-00272. [25] TheocharidisG,BaltzisD,RoustitM,et al.Integrated skin transcriptomics and serum multiplex assays reveal novel mechanisms of wound healing in diabetic foot ulcers[J].Diabetes,2020,69(10):2157-2169.DOI: 10.2337/db20-0188. [26] DinhHQ,PanF,WangG,et al.Integrated single-cell transcriptome analysis reveals heterogeneity of esophageal squamous cell carcinoma microenvironment[J].Nat Commun,2021,12(1):7335.DOI: 10.1038/s41467-021-27599-5. [27] 曾帅丹,杨磊.各种组学分析在体表慢性难愈合创面中的研究进展[J].中华烧伤与创面修复杂志,2023,39(1):75-80.DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20220216-00030. [28] WangZ,WeiD,LiS,et al.Healing mechanism of diabetic foot ulcers using single-cell RNA-sequencing[J].Ann Transl Med,2023,11(5):210.DOI: 10.21037/atm-23-240. [29] WilkinsonHN,ClowesC,BanyardKL,et al.Elevated local senescence in diabetic wound healing is linked to pathological repair via CXCR2[J].J Invest Dermatol,2019,139(5):1171-1181.e6.DOI: 10.1016/j.jid.2019.01.005. [30] XuJ,HuJ,Idlett-AliS,et al.Discovery of small molecule activators of chemokine receptor CXCR4 that improve diabetic wound healing[J].Int J Mol Sci,2022,23(4):2196.DOI: 10.3390/ijms23042196. [31] WilkinsonHN,HardmanMJ.Senescence in wound repair: emerging strategies to target chronic healing wounds[J].Front Cell Dev Biol,2020,8:773.DOI: 10.3389/fcell.2020.00773. [32] PeddibhotlaS,CaplesK,MehtaA,et al.Triazolothiadiazine derivative positively modulates CXCR4 signaling and improves diabetic wound healing[J].Biochem Pharmacol,2023,216:115764.DOI: 10.1016/j.bcp.2023.115764. [33] RestivoTE,MaceKA,HarkenAH,et al.Application of the chemokine CXCL12 expression plasmid restores wound healing to near normal in a diabetic mouse model[J].J Trauma,2010,69(2):392-398.DOI: 10.1097/TA.0b013e3181e772b0. [34] YeboahA,CohenRI,FaulknorR,et al.The development and characterization of SDF1α-elastin-like-peptide nanoparticles for wound healing[J].J Control Release,2016,232:238-247.DOI: 10.1016/j.jconrel.2016.04.020. [35] ShafiqM,YuanZ,RafiqueM,et al.Combined effect of SDF-1 peptide and angiogenic cues in co-axial PLGA/gelatin fibers for cutaneous wound healing in diabetic rats[J].Colloids Surf B Biointerfaces,2023,223:113140.DOI: 10.1016/j.colsurfb.2023.113140. -
图 1 基于单细胞转录组测序分析急性足外伤患者创缘皮肤组织和糖尿病足患者创缘皮肤组织Fb亚群中趋化因子配体与KC亚群中趋化因子受体的相互作用
注：图中最左侧字母A表示急性足外伤创缘皮肤组织,D表示糖尿病足创缘皮肤组织；CXCL为CXC趋化因子配体,CXCR为CXC趋化因子受体,ACKR3为非典型趋化因子受体3,Fb为成纤维细胞,KC为角质形成细胞；从左至右各列依次为Fb亚群1与Fb亚群5、Fb亚群1与KC亚群2、Fb亚群1与KC亚群4、Fb亚群1与KC亚群6、Fb亚群2与Fb亚群5、Fb亚群2与KC亚群2、Fb亚群2与KC亚群4、Fb亚群2与KC亚群6、Fb亚群3与Fb亚群1、Fb亚群3与Fb亚群3、Fb亚群3与Fb亚群5、Fb亚群3与Fb亚群6、Fb亚群3与KC亚群2、Fb亚群3与KC亚群4、Fb亚群3与KC亚群6、Fb亚群4与Fb亚群5、Fb亚群4与KC亚群2、Fb亚群4与KC亚群4、Fb亚群4与KC亚群6、Fb亚群5与Fb亚群5、Fb亚群5与KC亚群2、Fb亚群5与KC亚群4、Fb亚群5与KC亚群6、Fb亚群6与Fb亚群5、Fb亚群6与KC亚群2、Fb亚群6与KC亚群4、Fb亚群6与KC亚群6
图 2 2组HaCaT细胞划痕后各时间点迁移情况 倒置相差显微镜×200。2A、2B、2C.分别为正常CM组细胞划痕后0（即刻）、24、48 h的划痕面积,划痕面积逐渐变小；2D、2E、2F.分别为高糖CM组细胞划痕后0、24、48 h的划痕面积,图2E和2F剩余划痕面积分别较图2B和2C明显增大
注：CM为条件培养基；用常规培养人包皮成纤维细胞的上清液培养正常CM组细胞,用高浓度葡萄糖培养的人包皮成纤维细胞的上清液培养高糖CM组细胞
图 3 采用液相悬浮芯片检测常规培养人包皮成纤维细胞7 d的上清液（即正常CM）和用高浓度葡萄糖培养人包皮成纤维细胞 7 d的上清液（即高糖CM）中细胞因子含量
注：第1~5列为正常CM,第6~10列为高糖CM；CM为条件培养基,IL为白细胞介素,CXCL为CXC趋化因子配体,CCL为CC趋化因子配体,TNF为肿瘤坏死因子,GM-CSF为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子
图 4 蛋白质印迹法检测的2组HaCaT细胞培养48 h的CXCR4的蛋白表达
注：用常规培养人包皮成纤维细胞的上清液培养正常CM组细胞,用高浓度葡萄糖培养的人包皮成纤维细胞的上清液培养高糖CM组细胞；CM为条件培养基,CXCR4为CXC趋化因子受体4,GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶；条带图上方1和2分别表示正常CM组和高糖CM组
图 5 4组HaCaT细胞划痕后各时间点迁移情况 倒置相差显微镜×200。5A、5B、5C、5D.分别为正常CM组、正常CM+CXCL12组、高糖CM组和高糖CM+CXCL12组划痕后0（即刻）h划痕面积；5E、5F、5G、5H.分别为正常CM组、正常CM+CXCL12组、高糖CM组和高糖CM+CXCL12组划痕后24 h划痕面积,图5E剩余划痕面积最小,图5E、5F、5H剩余划痕面积小于图5G；5I、5J、5K、5L.分别为正常CM组、正常CM+CXCL12组、高糖CM组和高糖CM+CXCL12组划痕后48 h划痕面积,图5I、5J中基本未见划痕,图5K剩余划痕面积明显大于图5L
注：用常规培养人包皮成纤维细胞的上清液培养正常CM组细胞,用高浓度葡萄糖培养的人包皮成纤维细胞的上清液培养高糖CM组细胞,分别在正常CM组和高糖CM组处理的基础上用重组人CXCL12处理正常CM+CXCL12组和高糖CM+CXCL12组细胞；CM为条件培养基,CXCL12为CXC趋化因子配体12
图 6 蛋白质印迹法检测的4组HaCaT细胞培养48 h的CXCR4的蛋白表达
注：用常规培养人包皮成纤维细胞的上清液培养正常CM组细胞,用高浓度葡萄糖培养的人包皮成纤维细胞的上清液培养高糖CM组细胞,分别在正常CM组和高糖CM组处理的基础上用重组人CXCL12处理正常CM+CXCL12组、高糖CM+CXCL12组细胞；CM为条件培养基,CXCL12为CXC趋化因子配体12,CXCR4为CXC趋化因子受体4,GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶；条带图上方1、2、3、4分别表示正常CM组、正常CM+CXCL12组、高糖CM组和高糖CM+CXCL12组
引物名称 引物序列（5'→3'） 产物大小（bp） CXCL1 上游：GGGAATTCACCCCAAGAACATC 121 下游：GGATGCAGGATTGAGGCAAGC CXCL2 上游：CAAACCGAAGTCATAGCCACA 157 下游：TCCTTCAGGAACAGCCACCA CXCL8 上游：CATACTCCAAACCTTTCCACCC 164 下游：CATACTCCAAACCTTTCCACCC CXCL12 上游：TGAGCTACAGATGCCCATGC 103 下游：ACAATCTGAAGGGCACAGTTTG β肌动蛋白 上游：CACCCAGCACAATGAAGATCAAGAT 317 下游：CCAGTTTTTAAATCCTGAGTCAAGC 注：HFF为人包皮成纤维细胞,CXCL为CXC趋化因子配体 
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Table 2. 2组HaCaT细胞划痕后各时间点迁移率比较（%,
组别 样本数 24 h 48 h 正常CM组 3 54.06±1.95 82.66±2.75 高糖CM组 3 17.53±1.85 47.72±2.71 t值 23.50 15.65 P值 <0.001 <0.001 注：CM为条件培养基；用常规培养人包皮成纤维细胞的上清液培养正常CM组细胞,用高浓度葡萄糖培养的人包皮成纤维细胞的上清液培养高糖CM组细胞；时间因素主效应,F=4 592.04,P<0.001；处理因素主效应,F=363.46,P<0.001；两者交互作用,F=3.36,P=0.140
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Table 3. 4组HaCaT细胞划痕后各时间点迁移率比较（%,
组别 样本数 24 h 48 h 高糖CM组 3 16.27±1.10 26.33±3.02 正常CM组 3 55.95±5.73 100 高糖CM+CXCL12组 3 42.05±0.55 86.65±0.24 正常CM+CXCL12组 3 41.49±3.23 100 F值 73.22 1 622.80 P值 <0.001 <0.001 P1值 <0.001 <0.001 P2值 <0.001 <0.001 P3值 0.004 >0.999 P4值 >0.999 <0.001 注：用常规培养人包皮成纤维细胞的上清液培养正常CM组细胞,用高浓度葡萄糖培养的人包皮成纤维细胞的上清液培养高糖CM组细胞,分别在正常CM组和高糖CM组处理的基础上用重组人CXCL12处理正常CM+CXCL12组、高糖CM+CXCL12组细胞；CM为条件培养基,CXCL12为CXC趋化因子配体12；时间因素主效应,F=1 242.82,P<0.001；处理因素主效应,F=646.70,P<0.001；两者交互作用,F=85.46,P<0.001；F值、P值为组间各时间点总体比较所得；P1值、P2值分别为高糖CM组与正常CM组、高糖CM+CXCL12组比较所得,P3值、P4值分别为正常CM+CXCL12组与正常CM组、高糖CM+CXCL12组比较所得
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