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大鼠富血小板血浆凝胶对过表达胶质细胞源性神经营养因子的自体脂肪间充质干细胞的作用

蔡维霞 郑朝 刘佳琦 刘洋 张婷 计鹏 田晨阳

蔡维霞, 郑朝, 刘佳琦, 等. 大鼠富血小板血浆凝胶对过表达胶质细胞源性神经营养因子的自体脂肪间充质干细胞的作用[J]. 中华烧伤与创面修复杂志, 2024, 40(12): 1176-1183. DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20240408-00126.
引用本文: 蔡维霞, 郑朝, 刘佳琦, 等. 大鼠富血小板血浆凝胶对过表达胶质细胞源性神经营养因子的自体脂肪间充质干细胞的作用[J]. 中华烧伤与创面修复杂志, 2024, 40(12): 1176-1183. DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20240408-00126.
Cai WX,Zheng Z,Liu JQ,et al.Effect of rat platelet-rich plasma gel on autologous adipose-derived mesenchymal stem cells overexpressing glia-derived neurotrophic factor[J].Chin J Burns Wounds,2024,40(12):1176-1183.DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20240408-00126.
Citation: Cai WX,Zheng Z,Liu JQ,et al.Effect of rat platelet-rich plasma gel on autologous adipose-derived mesenchymal stem cells overexpressing glia-derived neurotrophic factor[J].Chin J Burns Wounds,2024,40(12):1176-1183.DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20240408-00126.

大鼠富血小板血浆凝胶对过表达胶质细胞源性神经营养因子的自体脂肪间充质干细胞的作用

doi: 10.3760/cma.j.cn501225-20240408-00126
基金项目: 

陕西省重点研发计划 2022SF-399

国家自然科学基金面上项目 81471879, 82172208

详细信息
    通讯作者:

    郑朝,Email:zz73553@163.com

Effect of rat platelet-rich plasma gel on autologous adipose-derived mesenchymal stem cells overexpressing glia-derived neurotrophic factor

Funds: 

Key Research and Development Plan of Shaanxi Province of China 2022SF-399

General Program of National Natural Science Foundation of China 81471879, 82172208

More Information
  • 摘要:   目的  探讨大鼠富血小板血浆(PRP)凝胶对过表达胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的自体脂肪间充质干细胞(ADSC)的作用。  方法  该研究为实验研究。取5只成年雄性SD大鼠,采用胶原酶消化法获取原代ADSC并成功鉴定。取第3代ADSC,按照随机数字表法(分组方法下同)分为感染空载腺病毒的阴性对照组和感染过表达GDNF腺病毒的过表达GDNF组。培养48 h后,大体观察细胞感染情况。另取5只成年雄性SD大鼠,采血后采用差速离心法获取PRP,制备成凝胶后采用扫描电子显微镜观察其微观结构。取第3代ADSC,加入PRP成胶前的混合液中,成胶后常规培养48 h,行苏木精-伊红染色和钙黄素/碘化丙啶染色观测细胞生长情况。将感染空载腺病毒的ADSC或感染过表达GDNF腺病毒的ADSC在PRP凝胶中进行常规培养。培养48 h后,采用钙黄素/碘化丙啶染色检测细胞生长情况;培养24、48、72 h及1、2、3、4周后,收集细胞培养基的上清液,采用酶标仪测定其吸光度值并计算GDNF含量,样本数为3;培养48 h后,采用免疫荧光法检测细胞表达施万细胞特异性标志物S100蛋白质的情况。  结果  培养48 h后,阴性对照组和过表达GDNF组中感染腺病毒的细胞占比均接近90%且生长状态良好。阴性对照组细胞正常生长;过表达GDNF组细胞的形态发生明显变化,80%~90%的细胞伸出2个或多个突起,且在细胞聚集的地方,突起交织成网。PRP凝胶呈三维网状结构,且孔径大小不一。培养48 h后,ADSC可以很好地附着于PRP凝胶,且活细胞占比达98%。培养48 h后,感染空载腺病毒的ADSC生长状态良好,且呈典型的ADSC样梭形生长;感染过表达GDNF腺病毒的ADSC生长状态良好,且多数细胞伸出2个或多个突起,突起聚集处交织成网。培养24、48、72 h及1、2、3、4周后,感染过表达GDNF腺病毒的ADSC培养基的上清液中GDNF含量分别为(90±10)、(133±15)、(150±10)、(137±15)、(132±18)、(120±10)、(127±16)pg/mL,均明显高于感染空载腺病毒的ADSC的(42±7)、(44±7)、(43±6)、(47±6)、(49±5)、(49±6)、(51±4)pg/mL,t值分别为6.20、8.08、15.18、9.12、7.99、9.61、7.86,P<0.05。培养48 h后,与感染空载腺病毒的ADSC相比,感染过表达GDNF腺病毒的ADSC中S100蛋白质表达明显增强。  结论  制备的自体三维PRP凝胶具有良好的生物相容性,可负载过表达GDNF的大鼠ADSC并缓释GDNF,诱导ADSC向高表达S100蛋白质的施万细胞分化。

     

  • (1)制备的富血小板血浆(PRP)凝胶具有多孔结构及良好生物相容性。

    (2)过表达胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的脂肪间充质干细胞,可以通过在PRP凝胶中缓释GDNF实现向高表达S100蛋白质的施万细胞分化。

    Highlights:

    (1)The prepared platelet-rich plasma (PRP) gel had porous structures and good biocompatibility.

    (2)Adipose-derived mesenchymal stem cells that overexpressing glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) could differentiate into Schwann cells highly expressing S100 protein through sustained release of GDNF in PRP gel.

    外周神经损伤后的修复一直是临床治疗和研究的难点[1]。由于移植自体神经来源有限,目前主要采用组织工程的方法来修复外周神经损伤。施万细胞在修复受损外周神经过程中具有极其重要的作用,但其来源有限、增殖能力弱;同时,施万细胞获取过程也会对供区造成创伤[2, 3]。近年来,干细胞在组织修复过程中的应用价值逐渐受到重视,一些干细胞可以分化为神经系统的细胞,还能分泌酸性钙结合蛋白S100(施万细胞特异性标志物)、胶质纤维酸性蛋白、神经生长因子等[4],促进神经组织的生长和修复,这为外周神经损伤的修复提供了新的治疗思路。脂肪间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cell,ADSC)具有多向分化潜能,还能分泌多种生长因子,同时具有来源广泛、获取简单、扩增迅速等优点,是比较理想的组织工程种子细胞[5, 6, 7]。近年来,ADSC联合组织工程材料在神经损伤后的修复中发挥了重要作用[8, 9, 10]。本研究以自体富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)为支架,制备负载过表达胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)的大鼠ADSC(GDNF-ADSC)的组织工程材料,进一步探究其在外周神经损伤修复中的作用。

    本实验研究经空军军医大学动物实验伦理委员会审批通过,批号:IACUC-20241416。

    10只健康清洁级、体重20~25 g成年雄性SD大鼠由空军军医大学动物中心提供,许可证号:SYXK(军)2012-0022。

    藻红蛋白标记的小鼠抗大鼠干细胞特异性标志物CD29、CD44、CD90单克隆抗体和藻红蛋白标记的小鼠抗大鼠间质细胞特异性标志物CD34、CD45单克隆抗体均购自美国Becton Dickinson公司,兔源性S100蛋白质单克隆抗体、Alexa Fluor 594标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体购自英国Abcam公司,活/死细胞染色试剂盒(主要染液为钙黄绿素/碘化丙啶)购自上海碧云天生物技术有限公司,胶原质购自上海麦克林生化科技有限公司,凝血酶购自北京索莱宝科技有限公司,大鼠GDNF的ELISA检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司,DMEM/F12培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司,大鼠ADSC成骨诱导/成脂诱导分化试剂盒(包括相关培养基及检测试剂)购自广州赛业科技有限公司,腺病毒载体(自带绿色荧光)购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司。

    Steri-Cycle 371型二氧化碳培养箱购自美国Thermo Fisher Scientific公司,FACS AriaⅢ型流式细胞仪购自美国BD公司,Evos FL Auto 2型荧光显微镜购自美国Invitrogen公司,倒置相差显微镜购自德国ZEISS公司,Infinite M200 Pro型全波长多功能酶标仪购自瑞士TECAN公司,Fsx100型全自动生物图像导航仪购自日本Olympus公司,S-4800型扫描电子显微镜购自日本日立公司。

    取5只SD大鼠,常规麻醉后脱臼处死,用体积分数75%乙醇浸泡腹部,剪开皮肤,暴露皮下脂肪层,然后取腹股沟脂肪,参照文献[11]采用胶原酶消化法获取原代ADSC,使用含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基(以下简称完全培养基)进行培养、传代。培养原代细胞7 d后,于倒置相差显微镜40倍放大倍数下观察细胞形态。

    取第3代细胞,按照1×105个/mL浓度接种于预先用明胶包被的6孔板中,待细胞生长至80%~90%融合时,加入成脂诱导/成骨诱导专用培养基。用成脂诱导专用培养基培养细胞14 d,按照说明书用油红O染色,然后于倒置相差显微镜40倍放大倍数下观察细胞形态。用成骨诱导专用培养基培养细胞21 d,按照说明书用茜素红染色,然后于倒置相差显微镜40倍放大倍数下观察细胞形态。

    取第3代细胞,培养24 h后分别加入藻红蛋白标记的小鼠抗大鼠CD29、CD34、CD44、CD45、CD90单克隆抗体(稀释比均为1∶100),使用流式细胞仪检测其表达情况。本实验重复3次。

    取第3代ADSC,按照1×105个/mL浓度接种于6孔板中,当细胞生长至40%~60%融合时,将细胞按照随机数字表法(分组方法下同)分为感染空载腺病毒的阴性对照组和感染过表达GDNF腺病毒的过表达GDNF组,并进行组名对应的处理。培养48 h后,于荧光显微镜40倍放大倍数下观察细胞荧光表达情况,反映细胞感染情况。

    1.4.1   PRP的制备

    取5只SD大鼠,按照50 mg/kg腹腔注射10 g/L戊巴比妥钠溶液进行麻醉,在严格无菌条件下进行心脏负压采血,参照文献[12, 13]进行差速离心后获取PRP。

    1.4.2   PRP凝胶的制备

    将1 mL的PRP加入1 mg的胶原质中吹打混匀,再加入10 U凝血酶充分混匀。取前述混合液加入24孔板,每孔1 mL,放置于37 ℃培养箱10 min后成胶(成胶条件,下同),即为PRP凝胶。常规冷冻、干燥处理后制样,然后于扫描电子显微镜50倍放大倍数下观察凝胶的微观结构。

    1.4.3   PRP凝胶中ADSC生长情况

    将1 mL PRP加入1 mg胶原质中吹打混匀。然后再加入400 μL含5×106个第3代ADSC的细胞悬液,再加入10 U凝血酶充分混匀。随即取24孔板并加入前述混合液,每孔1 mL,待其成胶后加入500 μL完全培养基,常规培养。培养48 h后,取已成胶的混合物并制作冰冻切片(厚度10 μm),常规行HE染色后在倒置相差显微镜20倍放大倍数下观察细胞于凝胶中的生长情况;行钙黄素/碘化丙啶染色于荧光显微镜40倍放大倍数下观察细胞染色情况,活细胞阳性染色为绿色、死细胞阳性染色为红色。

    取24孔板,在每孔中先加入1 mL的PRP和1 mg胶原质吹打混匀,然后加入400 μL含4×105个感染空载腺病毒的ADSC或感染过表达GDNF腺病毒的ADSC悬液,再加入10 U凝血酶,待其成胶后加入500 μL完全培养基进行常规培养。培养48 h后,同前制作冰冻切片、采用钙黄素/碘化丙啶染色,然后在荧光显微镜40倍放大倍数下观察细胞生长情况。培养24、48、72 h及1、2、3、4周后,收集细胞培养基的上清液。按照大鼠GDNF的ELISA检测试剂盒说明书,采用酶标仪测定该上清液在450 nm波长处的吸光度值并计算GDNF含量。样本数为3。

    取共聚焦皿,每皿加入0.2 mL的PRP凝胶,再分别加入0.5 mL含4×105个感染过表达GDNF腺病毒的ADSC悬液或感染空载腺病毒的ADSC悬液,进行常规培养。培养48 h后,同前制作冰冻切片并行免疫荧光染色,一抗为兔源性S100蛋白质单克隆抗体(稀释比为1∶100)、二抗为Alexa Fluor 594标记的山羊抗兔IgG 多克隆抗体(稀释比为1∶500)。用4',6-二脒基-2-苯基吲哚染核,封片后于倒置荧光显微镜200倍放大倍数下观察细胞表达S100蛋白质(阳性染色为红色)的情况。

    采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。所有计量资料数据均符合正态分布,以x¯±s表示,组间总体比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

    培养7 d,原代ADSC呈梭形、密集生长,呈典型的漩涡样排列(图1A)。成脂诱导培养14 d后,第3代ADSC的细胞质内有大量遮光性强的红色脂滴形成(图1B);成骨诱导培养21 d后,第3代ADSC的细胞膜表面、细胞质中均可见大量红色或紫红色颗粒状钙化结节(图1C)。流式细胞术检测显示,第3代ADSC中的CD29、CD44和CD90阳性细胞占比均>90%、CD34和CD45阳性细胞占比均<5%。

    图  1  原代大鼠脂肪间充质干细胞(ADSC)的鉴定 倒置相差显微镜×40。1A.原代ADSC培养48 h后呈典型的漩涡样排列;1B.第3代ADSC成脂诱导分化14 d后,细胞质内有大量遮光性强的红色脂滴;1C.第3代ADSC成骨诱导分化21 d后,细胞膜表面、细胞质中均可见大量红色或紫红色颗粒状钙化结节

    培养48 h后,阴性对照组和过表达GDNF组中感染腺病毒的细胞占比均接近90%,且生长状态良好。阴性对照组细胞正常生长;过表达GDNF组细胞的形态发生明显变化,80%~90%的细胞伸出2个或多个突起,且在细胞聚集的地方,突起交织成网。见图2

    图  2  第3代大鼠脂肪间充质干细胞感染腺病毒48 h后的生长情况 荧光显微镜×40。2A、2B、2C.分别为阴性对照组细胞感染及生长情况的荧光、非荧光、复合图,绝大多数细胞感染了腺病毒且生长状态良好;2D、2E、2F.分别为过表达GDNF组细胞感染及生长情况的荧光、非荧光、复合图,绝大多数细胞感染了腺病毒,且多数细胞有2个或多个突起
    注:GDNF为胶质细胞源性神经营养因子;阴性对照组、过表达GDNF组细胞分别感染空载腺病毒和过表达GDNF的腺病毒

    PRP凝胶呈三维网状结构,且孔径大小不一。培养48 h后,ADSC可以很好地附着于PRP凝胶,在凝胶孔隙中生长,且活细胞占比达98%。见图3

    图  3  富血小板血浆凝胶的微观结构及其中的单纯大鼠脂肪间充质干细胞在培养48 h后的生长情况。3A.凝胶呈三维网状,孔径大小不一 扫描电子显微镜×50;3B.细胞(蓝色箭头指示)可以附着在凝胶中生长 苏木精-伊红×20;3C.生长在凝胶中的绝大多数细胞为活细胞(绿色),死细胞(红色)很少 钙黄绿素-碘化丙啶×40

    培养48 h后,感染空载腺病毒的ADSC生长状态良好,且呈典型的ADSC样梭形生长;感染过表达GDNF腺病毒的ADSC生长状态良好,且多数细胞伸出2个或多个突起,突起聚集处交织成网。见图4

    图  4  2组感染腺病毒的大鼠脂肪间充质干细胞(ADSC)在富血小板血浆凝胶中培养48 h后的生长情况 绿色荧光蛋白×40。4A.感染空载腺病毒的ADSC细胞呈典型的ADSC样梭形生长;4B.感染过表达GDNF腺病毒的ADSC的多数细胞伸出2个或多个突起,突起聚集处交织成网状
    注:成功感染腺病毒的细胞呈绿色

    培养24、48、72 h及1、2、3、4周后,感染空载腺病毒的ADSC培养基的上清液中GDNF含量分别为(42±7)、(44±7)、(43±6)、(47±6)、(49±5)、(49±6)、(51±4)pg/mL明显高于感染过表达GDNF腺病毒的ADSC的(90±10)、(133±15)、(150±10)、(137±15)、(132±18)、(120±10)、(127±16)pg/mL(t值分别为6.20、8.08、15.18、9.12、7.99、9.61、7.86,P值分别为0.003、0.001、<0.001、<0.001、0.001、<0.001、0.001)。

    培养48 h后,与感染空载腺病毒的ADSC相比,感染过表达GDNF腺病毒的ADSC中S100蛋白质表达明显增强。见图5

    图  5  感染腺病毒的大鼠脂肪间充质干细胞(ADSC)在自体富血小板血浆凝胶中培养48 h后表达S100蛋白质的情况 Alexa Fluor 594-4',6-二脒基-2-苯基吲哚×200。5A、5B.分别为感染空载腺病毒的ADSC、感染过表达GDNF腺病毒的ADSC表达S100蛋白质的情况,图5B的黄色荧光强度明显较图5A强
    注:成功感染腺病毒的细胞呈绿色,细胞核阳性染色为蓝色,S100蛋白质阳性染色为红色,绿色和红色的复合色为黄色

    周围神经再生机制的相关研究已成为热点[14, 15, 16, 17, 18]。与中枢神经系统神经元不同,周围神经系统中神经元在损伤后具有完全再生的潜力,其中施万细胞在神经损伤后修复中发挥重要的作用。然而,单纯依靠施万细胞的增殖与修复功能,治疗周期长、治疗效果差,临床意义不大[19, 20]。ADSC具有多向分化潜能,作为种子细胞,可被用于修复外周神经损伤[21, 22, 23, 24]。然而,单纯移植的干细胞因在体内存活时间短而应用受限[25, 26]。有研究者用包裹ADSC的纤维蛋白神经管道桥接修复大鼠坐骨神经损伤,效果良好[27]。目前,用于周围神经损伤的主要材料有天然生物材料和人工合成材料。胶原广泛存在于哺乳动物体内,具有良好的组织相容性、可降解性,是理想的细胞载体材料,但因其机械强度差等不足无法单独作为支架材料使用[28, 29]。PRP 中富含多种蛋白、细胞因子和抗菌肽等多种生物活性物质,具有促进细胞增殖、分化,组织再生与修复等作用[30, 31, 32, 33, 34, 35]。有研究显示,PRP可以调节施万细胞增殖和神经因子的分泌,同时PRP可以促进轴突的生长[36, 37, 38, 39, 40]。本研究显示,PRP联合胶原可制备PRP凝胶,扫描电子显微镜显示其具有多孔结构,进一步地将ADSC培养在自体PRP凝胶中,细胞可以很好地附着于PRP凝胶的孔径中,且细胞活力及生长状况良好,说明细胞与自体PRP凝胶有很好的组织相容性。

    神经营养因子、神经生长因子等对神经再生至关重要[41, 42, 43]。研究显示,GDNF是生物活性很强的神经营养因子[44],可以保护、营养神经元,对于轴突的再生及延伸具有直接的营养和促进作用[45];此外,GDNF还可以诱导和促进施万细胞的再生、分化及迁移[46, 47]。研究表明,GDNF不仅能促进受损运动及感觉神经元的生长,而且有利于损伤神经突触的重建,促进损伤神经的修复[48, 49, 50]。神经受损后,施万细胞及神经元大量凋亡,导致合成的GDNF不足。外源性输注GDNF能在一定程度上促进损伤神经轴索再生,持续稳定靶向给药有利于损伤神经修复,但很难模拟出生理状态神经损伤后梯度性GDNF表达信号,且外源性输注或生物支架负载的GDNF无法长时间存活并发挥生物学效应[51]。因此,建立适宜的GDNF缓释系统至关重要。本研究将负载过表达GDNF的ADSC与自体PRP凝胶混合培养,达到了缓释GDNF的目的。同时,本研究将过表达GDNF的ADSC接种于自体PRP凝胶中,培养48 h后可见PRP凝胶中的细胞向神经样细胞分化,培养4周后仍可见细胞存活良好并且持续分泌GDNF。

    综上所述,本团队制备的PRP凝胶具有多孔结构,可以提供良好的细胞生长环境;ADSC可以很好地附着于自体PRP凝胶的孔径中,同时细胞活力及生长状况良好,提示细胞与自体PRP凝胶有很好的组织相容性;在PRP凝胶中生长的过表达GDNF的ADSC向神经样细胞分化,且持续4周仍存活良好并持续分泌GDNF。本研究有望为临床开展局部应用PRP联合缓释GDNF的ADSC治疗外周神经损伤提供依据,从根本上改变传统神经损伤相关因子的全身或局部使用方式,以进一步提高防治外周神经损伤的疗效。

    蔡维霞:酝酿和设计实验、起草文章、撰写和修改文章;郑朝:对文章的知识性内容作批评性审阅,行政、技术和经费支持;刘佳琦:对文章的知识性内容作批评性审阅;刘洋:采集、整理数据;张婷:分析、解释数据;计鹏:统计分析、论文修改;田晨阳:实施研究
    所有作者均声明不存在利益冲突
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  • 图  1  原代大鼠脂肪间充质干细胞(ADSC)的鉴定 倒置相差显微镜×40。1A.原代ADSC培养48 h后呈典型的漩涡样排列;1B.第3代ADSC成脂诱导分化14 d后,细胞质内有大量遮光性强的红色脂滴;1C.第3代ADSC成骨诱导分化21 d后,细胞膜表面、细胞质中均可见大量红色或紫红色颗粒状钙化结节

    图  2  第3代大鼠脂肪间充质干细胞感染腺病毒48 h后的生长情况 荧光显微镜×40。2A、2B、2C.分别为阴性对照组细胞感染及生长情况的荧光、非荧光、复合图,绝大多数细胞感染了腺病毒且生长状态良好;2D、2E、2F.分别为过表达GDNF组细胞感染及生长情况的荧光、非荧光、复合图,绝大多数细胞感染了腺病毒,且多数细胞有2个或多个突起

    注:GDNF为胶质细胞源性神经营养因子;阴性对照组、过表达GDNF组细胞分别感染空载腺病毒和过表达GDNF的腺病毒

    图  3  富血小板血浆凝胶的微观结构及其中的单纯大鼠脂肪间充质干细胞在培养48 h后的生长情况。3A.凝胶呈三维网状,孔径大小不一 扫描电子显微镜×50;3B.细胞(蓝色箭头指示)可以附着在凝胶中生长 苏木精-伊红×20;3C.生长在凝胶中的绝大多数细胞为活细胞(绿色),死细胞(红色)很少 钙黄绿素-碘化丙啶×40

    图  4  2组感染腺病毒的大鼠脂肪间充质干细胞(ADSC)在富血小板血浆凝胶中培养48 h后的生长情况 绿色荧光蛋白×40。4A.感染空载腺病毒的ADSC细胞呈典型的ADSC样梭形生长;4B.感染过表达GDNF腺病毒的ADSC的多数细胞伸出2个或多个突起,突起聚集处交织成网状

    注:成功感染腺病毒的细胞呈绿色

    图  5  感染腺病毒的大鼠脂肪间充质干细胞(ADSC)在自体富血小板血浆凝胶中培养48 h后表达S100蛋白质的情况 Alexa Fluor 594-4',6-二脒基-2-苯基吲哚×200。5A、5B.分别为感染空载腺病毒的ADSC、感染过表达GDNF腺病毒的ADSC表达S100蛋白质的情况,图5B的黄色荧光强度明显较图5A强

    注:成功感染腺病毒的细胞呈绿色,细胞核阳性染色为蓝色,S100蛋白质阳性染色为红色,绿色和红色的复合色为黄色

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