Effects of in situ cross-linked graphene oxide-containing gelatin methacrylate anhydride hydrogel on wound vascularization of full-thickness skin defect in mice
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摘要:
目的 制备含氧化石墨烯（GO）的甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）水凝胶并探讨原位光聚合GO-GelMA复合水凝胶对小鼠全层皮肤缺损创面血管化的影响。 方法 采用实验研究方法。将0.2 mg/mL的GO溶液50 μL均匀涂抹于导电胶上，烘干后于场发射扫描电子显微镜下观察GO的结构和大小。将人皮肤成纤维细胞（HSF）分为采用相应终质量浓度GO处理的0 μg/mL GO（不加GO溶液，下同）组、0.1 μg/mL GO组、1.0 μg/mL GO组、5.0 μg/mL GO组、10.0 μg/mL GO组，用酶标仪检测细胞培养48 h的吸光度值，以此表示细胞增殖活性（样本数为6）。将HSF和人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）分别分为采用相应终质量浓度GO处理的0 μg/mL GO组、0.1 μg/mL GO组、1.0 μg/mL GO组、5.0 μg/mL GO组，采用划痕试验检测划痕后24、36 h HSF的迁移率（样本数为5）及划痕后12 h HUVEC的迁移率（样本数为3），采用酶联免疫吸附测定法检测培养4、6、8 h后HSF分泌的血管内皮生长因子（VEGF）水平（样本数为3）。将配制的含相应终质量浓度GO的GO-GelMA复合水凝胶设为0 μg/mL GO复合水凝胶组、0.1 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组，观察其交联前后的性状，检测用磷酸盐缓冲液浸泡3、7 d后GO的释放情况（样本数为3）。在16只6周龄雌性C57BL/6小鼠背部制作全层皮肤缺损创面，将采用原位交联的含相应终质量浓度GO的GO-GelMA复合水凝胶处理的小鼠按随机数字表法分为0 μg/mL GO复合水凝胶组、0.1 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组，每组4只，观察治疗3、7、14 d创面大体情况并计算创面愈合率，采用激光多普勒血流仪检测治疗3、7、14 d创面血流灌注并计算平均灌注单位（MPU）比值，采用苏木精-伊红染色观察治疗7 d创面血管新生情况并计算血管密度（样本数均为3）。取0 μg/mL GO复合水凝胶组和0.1 μg/mL GO复合水凝胶组治疗7 d的创面组织，采用苏木精-伊红染色观察GO分布与血管新生的关系（样本数为3），行免疫组织化学染色后观察VEGF的表达。对数据行重复测量方差分析、单因素方差分析、Tukey法。 结果 GO为多层片状结构，宽度约为20 μm、长度约为50 μm。培养48 h，10.0 μg/mL GO组HSF的吸光度值明显低于0 μg/mL GO组（q=7.64，P<0.01）。划痕后24 h，4组HSF迁移率相近（P>0.05）；划痕后36 h，0.1 μg/mL GO组HSF迁移率明显高于0 μg/mL GO组、1.0 μg/mL GO组、5.0 μg/mL GO组（q值分别为7.48、10.81、10.20，P值均<0.01）。划痕后12 h，0.1 μg/mL GO组HUVEC迁移率明显高于0 μg/mL GO组、1.0 μg/mL GO组、5.0 μg/mL GO组（q值分别为7.11、8.99、14.92，P值均<0.01），5.0 μg/mL GO组HUVEC迁移率明显低于0 μg/mL GO组和1.0 μg/mL GO组（q值分别为7.81、5.33，P<0.05或P<0.01）。培养4、6 h，4组HSF的VEGF表达均相近（P>0.05）；培养8 h，0.1 μg/mL GO组HSF的VEGF表达明显高于0 μg/mL GO组和5.0 μg/mL GO组（q值分别为4.75、4.48，P值均<0.05）。4组GO-GelMA复合水凝胶在交联前均呈红色液体状，交联后呈微黄色凝胶状且流动性无明显差异。0 μg/mL GO复合水凝胶组复合水凝胶各时间点均无GO释放，其余3组GO-GelMA复合水凝胶中的GO于浸泡3 d部分释放，至浸泡7 d全部释放。治疗3~14 d，4组小鼠创面可见水凝胶敷料覆盖在位并保持湿润，创面逐渐愈合。治疗3、7、14 d，4组小鼠创面愈合率均相近（P>0.05）。治疗3 d，0.1 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面MPU比值明显高于0 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组（q值分别为10.70、11.83、10.65，P<0.05或P<0.01）。治疗7、14 d，4组小鼠创面MPU比值均相近（P>0.05）。0.1 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面治疗7 d的MPU比值明显低于治疗3 d（q=14.38，P<0.05），治疗14 d的MPU比值明显低于治疗7 d（q=27.78，P<0.01）。治疗7 d，0.1 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面新生血管密度为每200倍视野下（120.7±4.1）根，明显高于0 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组的每200倍视野下（61.7±1.3）、（77.7±10.2）、（99.0±7.9）根（q值分别为12.88、7.79、6.70，P值均<0.01）；1.0 μg/mL GO复合水凝胶组和5.0 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面新生血管密度均明显高于0 μg/mL GO复合水凝胶组（q值分别为5.10、6.19，P<0.05）。治疗7 d，相较于0 μg/mL GO复合水凝胶组，0.1 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面中成簇新生血管更多，且聚集于GO附近；0.1 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面中GO和新生血管分布区域有大量VEGF表达。 结论 GO质量浓度低于10.0 μg/mL对HSF增殖活性无明显影响，0.1 μg/mL的GO能够促进HSF和HUVEC迁移，能促进HSF分泌VEGF。原位光聚合GO-GelMA复合水凝胶敷料能够通过促进小鼠全层皮肤缺损创面血管新生，增加创面早期血流灌注，且GO对新生血管有富集作用，其机制可能与GO促进创面细胞分泌VEGF相关。 Abstract:Objective To prepare graphene oxide (GO)-containing gelatin methacrylate anhydride (GelMA) hydrogel and to investigate the effects of in situ photopolymerized GO-GelMA composite hydrogel in wound vascularization of full-thickness skin defect in mice. Methods The experimental study method was used. The 50 μL of 0.2 mg/mL GO solution was evenly applied onto the conductive gel, and the structure and size of GO were observed under field emission scanning electron microscope after drying. Human skin fibroblasts (HSFs) were divided into 0 μg/mL GO (without GO solution, the same as below) group, 0.1 μg/mL GO group, 1.0 μg/mL GO group, 5.0 μg/mL GO group, and 10.0 μg/mL GO group treated with GO of the corresponding final mass concentration, and the absorbance value was detected using a microplate analyzer after 48 h of culture to reflect the proliferation activity of cells (n=6). HSFs and human umbilical vein vascular endothelial cells (HUVECs) were divided into 0 μg/mL GO group, 0.1 μg/mL GO group, 1.0 μg/mL GO group, and 5.0 μg/mL GO group treated with GO of the corresponding final mass concentration, and the migration rates of HSFs at 24 and 36 h after scratching (n=5) and HUVECs at 12 h after scratching (n=3) were detected by scratch test, and the level of vascular endothelial growth factor (VEGF) secreted by HSFs after 4, 6, and 8 h of culture was detected by enzyme-linked immunosorbent assay method (n=3). The prepared GO-GelMA composite hydrogels containing GO of the corresponding final mass concentration were set as 0 μg/mL GO composite hydrogel group, 0.1 μg/mL GO composite hydrogel group, 1.0 μg/mL GO composite hydrogel group, and 5.0 μg/mL GO composite hydrogel group to observe their properties before and after cross-linking, and to detect the release of GO after soaking with phosphate buffer solution for 3 and 7 d (n=3). The full-thickness skin defect wounds were made on the back of 16 6-week-old female C57BL/6 mice. The mice treated with in situ cross-linked GO-GelMA composite hydrogel containing GO of the corresponding final mass concentration were divided into 0 μg/mL GO composite hydrogel group, 0.1 μg/mL GO composite hydrogel group, 1.0 μg/mL GO composite hydrogel group, and 5.0 μg/mL GO composite hydrogel group according to the random number table, with 4 mice in each group. The general condition of wound was observed and the wound healing rate was calculated on 3, 7, and 14 d of treatment, the wound blood perfusion was detected by laser Doppler flowmetry on 3, 7, and 14 d of treatment and the mean perfusion unit (MPU) ratio was calculated, and the wound vascularization on 7 d of treatment was observed after hematoxylin-eosin staining and the vascular density was calculated (n=3). The wound tissue of mice in 0 μg/mL GO composite hydrogel group and 0.1 μg/mL GO composite hydrogel group on 7 d of treatment was collected to observe the relationship between the distribution of GO and neovascularization by hematoxylin-eosin staining (n=3) and the expression of VEGF by immunohistochemical staining. Data were statistically analyzed with analysis of variance for repeated measurement, one-way analysis of variance, and Tukey's method. Results GO had a multilayered lamellar structure with the width of about 20 μm and the length of about 50 μm. The absorbance value of HSFs in 10.0 μg/mL GO group was significantly lower than that in 0 μg/mL GO group after 48 h of culture (q=7.64, P<0.01). At 24 h after scratching, the migration rates of HSFs were similar in the four groups (P>0.05); at 36 h after scratching, the migration rate of HSFs in 0.1 μg/mL GO group was significantly higher than that in 0 μg/mL GO group, 1.0 μg/mL GO group, and 5.0 μg/mL GO group (with q values of 7.48, 10.81, and 10.20, respectively, P<0.01). At 12 h after scratching, the migration rate of HUVECs in 0.1 μg/mL GO group was significantly higher than that in 0 μg/mL GO group, 1.0 μg/mL GO group, and 5.0 μg/mL GO group (with q values of 7.11, 8.99, and 14.92, respectively, P<0.01), and the migration rate of HUVECs in 5.0 μg/mL GO group was significantly lower than that in 0 μg/mL GO group and 1.0 μg/mL GO group (with q values of 7.81 and 5.33, respectively, P<0.05 or P<0.01 ). At 4 and 6 h of culture, the VEGF expressions of HSFs in the four groups were similar (P>0.05); at 8 h of culture, the VEGF expression of HSFs in 0.1 μg/mL GO group was significantly higher than that in 0 μg/mL GO group and 5.0 μg/mL GO group (with q values of 4.75 and 4.48, respectively, P<0.05). The GO-GelMA composite hydrogels in the four groups were all red liquid before cross-linking, which turned to light yellow gel after cross-linking, with no significant difference in fluidity. The GO in the GO-GelMA composite hydrogel of 0 μg/mL GO composite hydrogel group had no release of GO at all time points; the GO in the GO-GelMA composite hydrogels of the other 3 groups was partially released on 3 d of soaking, and all the GO was released on 7 d of soaking. From 3 to 14 d of treatment, the wounds of mice in the 4 groups were covered with hydrogel dressings, kept moist, and gradually healed. On 3, 7, and 14 d of treatment, the wound healing rates of mice in the four groups were similar (P>0.05). On 3 d of treatment, the MPU ratio of wound of mice in 0.1 μg/mL GO composite hydrogel group was significantly higher than that in 0 μg/mL GO composite hydrogel group, 1.0 μg/mL GO composite hydrogel group, and 5.0 μg/mL GO composite hydrogel group (with q values of 10.70, 11.83, and 10.65, respectively, P<0.05 or P<0.01). On 7 and 14 d of treatment, the MPU ratios of wound of mice in the four groups were similar (P>0.05). The MPU ratio of wound of mice in 0.1 μg/mL GO composite hydrogel group on 7 d of treatment was significantly lower than that on 3 d of treatment (q=14.38, P<0.05), and that on 14 d of treatment was significantly lower than that on 7 d of treatment (q=27.78, P<0.01). On 7 d of treatment, the neovascular density of wound of mice on 7 d of treatment was 120.7±4.1 per 200 times of visual field, which was significantly higher than 61.7±1.3, 77.7±10.2, and 99.0±7.9 per 200 times of visual field in 0 μg/mL GO composite hydrogel group, 1.0 μg/mL GO composite hydrogel group, and 5.0 μg/mL GO composite hydrogel group (with q values of 12.88, 7.79, and 6.70, respectively, P<0.01), and the neovascular density of wound of mice in 1.0 μg/mL GO composite hydrogel group and 5.0 μg/mL GO composite hydrogel group was significantly higher than that in 0 μg/mL GO composite hydrogel group (with q values of 5.10 and 6.19, respectively, P<0.05). On 7 d of treatment, cluster of new blood vessels in wound of mice in 0.1 μg/mL GO composite hydrogel group was significantly more than that in 0 μg/mL GO composite hydrogel group, and the new blood vessels were clustered near the GO; a large amount of VEGF was expressed in wound of mice in 0.1 μg/mL GO composite hydrogel group in the distribution area of GO and new blood vessels. Conclusions GO with mass concentration lower than 10.0 μg/mL had no adverse effect on proliferation activity of HSFs, and GO of 0.1 μg/mL can promote the migration of HSFs and HUVECs, and can promote the secretion of VEGF in HSFs. In situ photopolymerized of GO-GelMA composite hydrogel dressing can promote the wound neovascularization of full-thickness skin defect in mice and increase wound blood perfusion in the early stage, with GO showing an enrichment effect on angiogenesis, and the mechanism may be related to the role of GO in promoting the secretion of VEGF by wound cells. -
(1)制备了含氧化石墨烯（GO）的甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）水凝胶，进一步观察到原位光聚合含0.1 μg/mL GO的GelMA水凝胶能促进小鼠全层皮肤缺损创面血管新生，且新生血管富集于GO附近。
(2)证实GO的促血管新生作用与创面细胞分泌的VEGF增加相关。
原位生物打印也被称为“体内”生物打印［1］，目的是在原位修复和重建有缺损的组织［2, 3, 4］。皮肤作为人体最大、最浅表的器官，已经成为原位生物打印的最基础且最有潜力的研究模型［5, 6, 7］。在原位生物打印技术中，可光聚合生物材料——甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）是目前应用最广泛的生物墨水基质，其不仅具有天然ECM的良好生物相容性［8, 9, 10］，而且物理性质可以改变，兼具合成材料的稳定性和可重复性，因此被广泛应用于组织工程和再生医学领域研究中［11, 12, 13］。虽然GelMA有诸多优点，但是将原位成形后的GelMA应用于猪全层皮肤缺损创面，组织的血管化不足阻碍进一步组织修复［14］。为解决这个问题，研究者将FGF、内皮集落形成细胞和间充质干细胞加入GelMA中以促进大鼠颅骨愈合过程中和小鼠体内的血管生成，但生长因子等快速降解会使其促血管化的效果大打折扣，细胞成分的安全性和伦理问题也制约其应用［15, 16, 17］。因此，亟待寻找一种可以稳定存在、安全性好且促血管化效果显著的生物墨水添加剂。
氧化石墨烯（GO）是一种二维碳质纳米材料，呈六方碳结构，能够提高一些天然聚合物的机械强度和导电性［18, 19］，同时有较好的生物相容性，能促进细胞增殖和黏附［20, 21, 22］，因此在生物研究领域具有广泛的应用前景。研究表明，用GO处理人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）可以使大鼠颅骨缺损区血管网数量显著增加［23］；另有研究表明，GO可使HUVEC内产生活性氧自由基，激活一氧化氮信号通路，促进小鸡绒毛尿囊膜中的血管生成［21，24］。但将GO用于治疗皮肤创面是否具有理想的原位修复和血管化效应，以及该生物学效应是否与生长因子相关，目前尚无定论。因此，本研究首先分析GO对人皮肤Fb（HSF）和HUVEC生物学行为的影响，并明确可用于创面治疗的GO浓度范围；其次制备了原位光聚合的含有GO的GelMA水凝胶敷料，并观测其在大鼠全层皮肤缺损创面治疗中的原位修复效应和促血管化效应；最后通过观察创面的病理学改变，对血管化效应与GO-GelMA复合水凝胶的关系进行初步探讨。
1. 材料与方法
本实验研究经解放军总医院伦理委员会审批通过（批号：伦审第S2020-120-01号），遵循国家和解放军总医院有关实验动物管理和使用的相关规定。
1.1 动物及主要材料来源
16只健康无特殊病原体级6周龄体重20 g雌性C57BL/6小鼠，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2019-0040。GelMA及光引发剂（主要成分：伊红Y、三乙醇胺和1-乙烯基-2-吡咯烷酮）由中国科学院理化技术研究所黄星助理研究员提供。0.2 mg/mL GO由北京科技大学材料科学与工程学院牛康民教授提供。HSF和HUVEC及其专用培养基购自赛百慷（上海）生物技术股份有限公司。兔抗小鼠VEGFA单克隆抗体购自美国Abcam公司，二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠/兔IgG聚合物购自北京中杉金桥生物技术有限公司，小鼠VEGF的ELISA检测试剂盒购自武汉基因美生物科技有限公司，细胞计数试剂盒8（CCK-8）和HE染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，医用胶布购自江苏广益医用敷料有限公司。BBD 6620型二氧化碳培养箱购自美国Thermo Fisher Scientific公司，Spark 10M型多功能酶标仪购自瑞士TECAN公司，BM14000型倒置荧光显微镜购自德国Leica公司，PeriCam PSI D005型激光多普勒血流仪购自瑞典Perimed公司，BX43型光学显微镜购自日本Olympus公司，S-4300型场发射扫描电子显微镜购自日本HITACHI公司。
1.2 GO的理化性质
将50 μL质量浓度为0.2 mg/mL的GO溶液均匀涂抹一薄层于导电胶上，将其烘干后置于500倍场发射扫描电子显微镜下观测GO的结构和大小。
1.3 GO对HSF和HUVEC生物学行为的影响
1.3.1 GO对HSF的细胞毒性
取100 μL的HSF悬液于96孔板中，用HSF专用培养基培养，每孔5 000个细胞，将培养板放在37 ℃、含体积分数5%二氧化碳培养箱中预培养（培养条件下同）24 h。将细胞分成0 μg/mL GO组、0.1 μg/mL GO组、1.0 μg/mL GO组、5.0 μg/mL GO组、10.0 μg/mL GO组，每组6孔，分别加入终质量浓度分别为0（不加GO溶液，下同）、0.1、1.0、5.0、10.0 μg/mL的GO溶液，常规培养48 h。每孔加10 μL CCK-8溶液，继续常规培养1 h，用酶标仪测定波长450 nm处的吸光度值，以此表示HSF增殖活性。本实验重复3次。
1.3.2 GO对HSF和HUVEC迁移的影响
分别用HSF和HUVEC专用培养基调整HSF和HUVEC浓度为2×105个/mL并接种于6孔板中，每孔2 mL，将2种细胞分别分为0 μg/mL GO组、0.1 μg/mL GO组、1.0 μg/mL GO组、5.0 μg/mL GO组，每组3孔。细胞贴壁后弃去原有培养基，使用规格为200 μL移液器枪头在培养孔正中垂直于培养孔划一竖痕，用PBS清洗后，每孔加入2 mL含GO的含终体积分数1%胎牛血清的相应细胞的专用培养基，各组细胞中加入的GO终质量浓度分别为0、0.1、1.0、5.0 μg/mL。于50倍倒置荧光显微镜下（非荧光条件）观察划痕后24、36 h HSF及划痕后12 h HUVEC的迁移情况并采集图片，每组HSF选5个视野，每组HUVEC选3个视野，采用Image J 1.8.0图像分析软件（美国国立卫生研究院）计算剩余划痕面积。计算HSF划痕后24、36 h和HUVEC划痕后12 h的迁移率。细胞迁移率=（初始划痕面积-划痕后各时间点剩余划痕面积）÷初始划痕面积×100%。本实验重复3次。
1.3.3 GO对HSF分泌VEGF的影响
将HSF接种于直径为6 cm的培养皿中，用HSF专用培养基培养，每皿细胞数为5×105个，共4皿，分别为0 μg/mL GO组、0.1 μg/mL GO组、1.0 μg/mL GO组、5.0 μg/mL GO组。细胞贴壁后弃去原有培养基，分别加入含GO终质量浓度分别为0、0.1、1.0、5.0 μg/mL的HSF专用培养基，每皿4 mL，同前常规培养，分别于培养4、6、8 h后，每皿收集200 μL细胞培养上清液于无菌管中，以离心半径8.0 cm、3 000 r/min离心20 min左右。按照小鼠VEGF ELISA试剂盒说明书进行操作，检测波长450 nm下的吸光度值，计算VEGF表达水平。本实验重复3次。
1.4 GO-GelMA复合水凝胶的制备和性状观察以及复合水凝胶中GO的释放
1.4.1 GO-GelMA复合水凝胶的制备及性状观察
取1 g GelMA，加入10 mL配制的光引发剂溶液中，放入37 ℃水浴锅使GelMA充分溶解，经孔径0.22 μm的过滤器过滤，得到无菌的GelMA。配制质量浓度分别为0、0.1、1.0、5.0 μg/mL的GO溶液，混入GelMA后，得到含4种不同终质量浓度GO的GO-GelMA复合水凝胶，分别为0 μg/mL GO复合水凝胶组、0.1 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组。取4组复合水凝胶于透明玻璃瓶中，每组1 mL，使用发光二极管（LED）白光照射2 min进行交联，观察交联前后复合水凝胶的性状。
1.4.2 GO-GelMA复合水凝胶中GO的释放
取1.4.1制备的0 μg/mL GO复合水凝胶组、0.1 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组GO-GelMA复合水凝胶，每组0.1 mL，置于直径3 cm的培养皿中，于37 ℃在1 mL PBS中浸泡3、7 d，取出后将复合水凝胶烘干并称其重量（W2）。另取4组复合水凝胶各0.1 mL，烘干后称其重量（W1）。计算复合水凝胶中GO的释放量，GO的释放量=（W1-W2）÷W1×100%×复合水凝胶体积×GO质量浓度。4组样本数均为3。
1.5 原位光聚合GO-GelMA复合水凝胶在小鼠全层皮肤缺损创面中的作用
1.5.1 小鼠背部全层皮肤缺损创面模型的建立及分组处理
取16只小鼠，称重后按50 mg/kg腹腔注射20 g/L戊巴比妥钠麻醉，于每只小鼠背部正中制备直径1 cm的圆形全层皮肤缺损创面。将小鼠分为0 μg/mL GO复合水凝胶组、0.1 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组，每组4只。伤后即刻在背部创面滴加100 μL含相应终质量浓度GO的复合水凝胶，然后使用LED白光照射2 min进行原位交联。外用医用胶布覆盖并包扎固定，持续治疗14 d。创面每2天更换医用胶布1次，保证水凝胶敷料处于湿润状态且持续覆盖于创面。
1.5.2 创面大体观察和创面愈合率
每组各取3只小鼠，于治疗0（即刻）、3、7、14 d拍照，采用Image J 1.8.0图像分析软件测量创面面积，并计算治疗3、7、14 d的创面愈合率。创面愈合率=（治疗0 d创面面积-治疗各时间点创面面积）÷治疗0 d创面面积×100%。
1.5.3 创面血流灌注
每组各取3只小鼠，于治疗3、7、14 d，使用激光多普勒血流仪检测创面血流灌注。激光多普勒血流仪使用不可见近红外激光（785 nm）产生散斑图案，通过分析散斑图案的变化计算平均灌注单位（MPU），血流灌注情况通过直观观察：黑色代表无血流灌注，绿色代表血流灌注少，红色代表血流灌注多。激光多普勒血流仪操作要求：（1）每次测量在同一位置，保持同样的光线及温度条件，由同一人操作；（2）每次测量区域固定，即测量面积为0.25 cm2的创面区域和距创缘0.5 cm处面积为0.25 cm2的正常组织区域；（3）测量时仪器与测量部位垂直，垂直距离为（10.0±0.5）cm。用MPU比值来量化创面的血流灌注，MPU比值=创面中心MPU÷距创缘0.5 cm的正常组织MPU。
1.5.4 创面组织病理学观察
1.5.4 .1 HE染色观察创面血管新生情况及GO分布与新生血管的位置关系
治疗7 d，每组各取1只小鼠，采用颈椎脱臼法处死并收集背部创面及距创缘0.5 cm内的组织，用40 g/L多聚甲醛固定，进行常规石蜡包埋、切片（厚度为5 μm），60 ℃下烘烤4 h。将切片浸在二甲苯中脱蜡2次，每次10 min；然后用梯度乙醇进行脱水。加入苏木精染液染色5 min，水洗后，加入乙醇盐酸溶液分化3 s，水洗，加入伊红溶液染色1 min后，水洗。用梯度乙醇脱水，并用二甲苯透明2次，每次1 min，最后用中性树胶封片并盖上盖玻片。取4组小鼠组织切片，于200倍光学显微镜下观察并计算创面组织新生血管密度（每组选取3个视野）；取0 μg/mL GO复合水凝胶组和0.1 μg/mL GO复合水凝胶组组织切片，于400倍光学显微镜下观察GO分布与新生血管的位置关系。
1.5.4 .2 免疫组织化学染色检测创面组织VEGF的表达
取1.5.4.1制作的治疗7 d 的0 μg/mL GO复合水凝胶组和0.1 μg/mL GO复合水凝胶组组织切片、烘烤、脱蜡及梯度乙醇脱水，加入内源性过氧化物酶阻断剂，用体积分数5%山羊血清室温封闭1 h。滴加兔抗小鼠VEGFA单克隆一抗（稀释比为1∶200），4 ℃孵育过夜后，37 ℃复温30 min，PBS冲洗；滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠/兔IgG聚合物，室温孵育20 min。PBS冲洗后加入适量新鲜配制的DAB显色液，室温孵育2 min，加入苏木精染色液孵育2 min。将组织用梯度乙醇脱水并用二甲苯透明2次，每次1 min，最后用中性树胶封片并盖上盖玻片封固，于400倍光学显微镜下观察创面组织VEGF的表达（阳性染色为深褐色）。
1.6 统计学处理
采用SPSS 24.0统计软件进行分析。所有计量资料数据均符合正态分布，以
2. 结果
2.1 GO的理化性质
GO为多层片状结构，宽度约为20 μm、长度约为50 μm。见图1。
2.2 GO对HSF和HUVEC生物学行为的影响
2.2.1 GO对HSF增殖活性的影响
培养48 h，0.1 μg/mL GO组、1.0 μg/mL GO组、5.0 μg/mL GO组HSF的吸光度值与0 μg/mL GO组无明显差别（q值分别为0.31、3.44、3.19，P值分别为>0.999、0.140、0.192）；10.0 μg/mL GO组HSF的吸光度值明显低于0 μg/mL GO组（q=7.64，P<0.001），故后续实验中弃用10.0 μg/mL GO。见图2。
2 细胞计数试剂盒8法检测5组人皮肤成纤维细胞培养48 h后的吸光度值 (样本数为6，2.2.2 GO对HSF和HUVEC迁移的影响
划痕后24 h，4组HSF迁移率总体比较，差异无统计学意义（P>0.05）。划痕后36 h，0.1 μg/mL GO组HSF迁移率最高，明显高于0 μg/mL GO组、1.0 μg/mL GO组、5.0 μg/mL GO组（q值分别为7.48、10.81、10.20，P值均<0.001），而0 μg/mL GO组HSF迁移率与1.0 μg/mL GO组、5.0 μg/mL GO组无明显差异（q值分别为3.33、2.72，P值分别为0.107、0.240），1.0 μg/mL GO组和5.0 μg/mL GO组HSF迁移率无明显差异（q=0.61，P=0.973）。见图3、表1。
3 划痕试验观察4组人皮肤成纤维细胞划痕后36 h的迁移情况 倒置荧光显微镜×50，图中标尺为500 μm。3A、3B、3C、3D.分别为0 μg/mL GO组、0.1 μg/mL GO组、1.0 μg/mL GO组、5.0 μg/mL GO组细胞迁移情况，图3B剩余划痕面积最小，图3A、3C、3D剩余划痕面积相近且均明显大于图3B注：GO为氧化石墨烯表1 4组人皮肤成纤维细胞划痕后各时间点细胞迁移率比较（%，组别 样本数 24 h 36 h 0 μg/mL GO组 5 23.5±7.7 55.0±7.2a 0.1 μg/mL GO组 5 30.1±1.1 82.2±13.9 1.0 μg/mL GO组 5 19.1±6.9 42.8±2.6a 5.0 μg/mL GO组 5 19.1±8.9 45.1±9.5a F值 2.85 19.08 P值 0.070 <0.001 注：GO为氧化石墨烯；处理因素主效应，F=1.97，P=0.159；时间因素主效应，F=441.00，P<0.001；两者交互作用，F=0.71，P=0.641；F值、P值为组间各时间点总体比较所得；与0.1 μg/mL GO组比较， aP<0.01 划痕后12 h，0 μg/mL GO组、0.1 μg/mL GO组、1.0 μg/mL GO组、5.0 μg/mL GO组HUVEC的迁移率分别为（20.6±3.3）%、（39.1±4.7）%、（15.7±5.8）%、（3.0±1.6）%，组间总体比较，差异明显（F=37.78，P<0.001）。0.1 μg/mL GO组HUVEC的迁移率明显高于0 μg/mL GO组、1.0 μg/mL GO组以及5.0 μg/mL GO组（q值分别为7.11、8.99、14.92，P值分别为0.005、0.001、<0.001），1.0 μg/mL GO组HUVEC迁移率和0 μg/mL GO组无明显差异（q=1.88，P=0.573），5.0 μg/mL GO组HUVEC迁移率明显低于0 μg/mL GO组和1.0 μg/mL GO组（q值分别为7.81、5.33，P值分别为0.003、0.023）。见图4。
4 划痕试验观察4组人脐静脉血管内皮细胞划痕后12 h的迁移情况 倒置荧光显微镜×50，图中标尺为500 μm。4A、4B、4C、4D.分别为0 μg/mL GO组、0.1 μg/mL GO组、1.0 μg/mL GO组、5.0 μg/mL GO组细胞迁移情况，图4B剩余划痕面积最小，图4A、4C、4D剩余划痕面积相似且均大于图4B注：GO为氧化石墨烯2.2.3 GO对HSF分泌VEGF的影响
培养4、6 h，4组HSF的VEGF表达均相近（P>0.05）。培养8 h，0.1 μg/mL GO组HSF的VEGF表达明显高于0 μg/mL GO组和5.0 μg/mL GO组（q值分别为4.75、4.48，P值分别为0.013、0.020），与1.0 μg/mL GO组无明显差异（q=3.50，P=0.090）；0 μg/mL GO组HSF的VEGF表达和1.0 μg/mL GO组、5.0 μg/mL GO组无明显差异（q值分别为1.26、0.27，P值分别为0.811、0.997）；1.0 μg/mL GO组HSF的VEGF表达和5.0 μg/mL GO组无明显差异（q=0.98，P=0.898）。见表2。
表2 4组人皮肤成纤维细胞培养各时间点血管内皮生长因子的表达比较（组别 样本数 4 h 6 h 8 h 0 μg/mL GO组 3 17.90±0.89 17.14±0.92 17.11±1.28a 0.1 μg/mL GO组 3 17.72±0.45 19.62±1.64 19.56±0.51 1.0 μg/mL GO组 3 16.98±0.53 17.31±1.21 17.76±0.86 5.0 μg/mL GO组 3 16.78±0.59 17.07±0.08 17.25±0.60a F值 2.25 3.61 5.11 P值 0.159 0.065 0.029 注：GO为氧化石墨烯；处理因素主效应，F=8.52，P<0.001；时间因素主效应，F=1.35，P=0.279；两者交互作用，F=1.52，P=0.215；F值、P值为组间各时间点总体比较所得；与0.1 μg/mL GO组比较，aP<0.05 2.3 GO-GelMA复合水凝胶的性状及GO的释放
2.3.1 GO-GelMA复合水凝胶的性状
0 μg/mL GO复合水凝胶组、0.1 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组复合水凝胶在交联前均呈红色液体状，交联后呈微黄色凝胶状，且5.0 μg/mL GO复合水凝胶组复合水凝胶交联后颜色最深。4组复合水凝胶交联后的流动性无明显差异，见图5。
5 4组GO-GelMA复合水凝胶交联前后性状。5A、5B、5C、5D.分别为交联前0 μg/mL GO复合水凝胶组、0.1 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组，均为红色液体状；5E、5F、5G、5H.分别为交联后0 μg/mL GO复合水凝胶组、0.1 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组，均为微黄色凝胶状，且5.0 μg/mL GO复合水凝胶组颜色最深，4组流动性无明显差别注：GO为氧化石墨烯，GelMA为甲基丙烯酸酐化明胶2.3.2 GO-GelMA复合水凝胶中GO的释放
浸泡3、7 d，0 μg/mL GO复合水凝胶组复合水凝胶中均无GO释放。浸泡3 d，0.1 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组复合水凝胶中GO释放量分别约为0.003、0.031、0.166 μg；浸泡7 d，0.1 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组复合水凝胶中GO释放量分别为0.010、0.100、0.500 μg，即3组复合水凝胶中GO完全释放。
2.4 原位光聚合GO-GelMA复合水凝胶在小鼠全层皮肤缺损创面中的作用
2.4.1 创面大体观察和创面愈合率
治疗0 d，4组复合水凝胶均在小鼠创面原位交联固化，形成半透明水凝胶敷料。治疗3、7 d，4组小鼠创面可见水凝胶敷料覆盖在位并保持湿润，创面均未见明显渗出且均有不同程度缩小；治疗14 d，4组小鼠创面均基本愈合，未见水凝胶敷料残留。治疗3、7、14 d，4组小鼠创面愈合率比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表3、图6。
表3 4组小鼠全层皮肤缺损创面经GO-GelMA复合水凝胶治疗各时间点创面愈合率比较（%，组别 样本数 3 d 7 d 14 d 0 μg/mL GO复合水凝胶组 3 22.1±5.5 66.5±8.8 97.1±2.0 0.1 μg/mL GO复合水凝胶组 3 30.8±7.9 66.5±4.9 94.5±1.4 1.0 μg/mL GO复合水凝胶组 3 30.8±9.6 72.4±5.7 97.3±1.0 5.0 μg/mL GO复合水凝胶组 3 33.3±6.4 70.3±4.5 97.8±1.0 F值 1.32 0.89 5.77 P值 0.316 0.434 0.062 注：GO为氧化石墨烯，GelMA为甲基丙烯酸酐化明胶；处理因素主效应，F=2.89，P=0.068；时间因素主效应，F=656.20，P<0.001；两者交互作用，F=1.06，P=0.405；F值、P值为组间各时间点总体比较所得 
6 4组小鼠全层皮肤缺损创面经GO-GelMA复合水凝胶治疗各时间点愈合情况。6A、6B、6C、6D.分别为治疗3 d时0 μg/mL GO复合水凝胶组、0.1 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组，创面均不同程度缩小；6E、6F、6G、6H.分别为治疗14 d 时0 μg/mL GO复合水凝胶组、0.1 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组，创面均基本愈合，且均未见水凝胶敷料残留注：GO为氧化石墨烯，GelMA为甲基丙烯酸酐化明胶2.4.2 创面血流灌注
治疗3 d，0.1 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面的MPU比值明显高于0 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组（q值分别为10.70、11.83、10.65，P值分别为0.007、0.011、0.009），0 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面的MPU比值与1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组无明显差异（q值分别为0.42、0.75，P值分别为0.989、0.948），1.0 μg/mL GO复合水凝胶组和5.0 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面MPU比值无明显差异（q=0.45，P=0.987）。治疗7、14 d，4组小鼠创面的MPU比值总体比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。0.1 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面MPU比值在治疗3 d达到峰值，随后呈下降趋势；0.1 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面治疗7 d的MPU比值明显低于治疗3 d（q=14.38，P=0.024），治疗14 d的MPU比值明显低于治疗7 d（q=27.78，P=0.007）。见表4、图7。
表4 4组小鼠全层皮肤缺损创面经GO-GelMA复合水凝胶治疗各时间点MPU比值比较 （组别 样本数 3 d 7 d 14 d 0 μg/mL GO复合水凝胶组 3 1.77±0.11a 1.29±0.16 1.85±0.22 0.1 μg/mL GO复合水凝胶组 3 2.68±0.16b 2.13±0.24 1.46±0.24d 1.0 μg/mL GO复合水凝胶组 3 1.80±0.08c 1.74±0.17 2.45±0.56 5.0 μg/mL GO复合水凝胶组 3 1.82±0.11a 1.87±0.30 1.75±0.36 F值 30.22 7.83 3.07 P值 0.011 0.093 0.201 注：GO为氧化石墨烯，GelMA为甲基丙烯酸酐化明胶，MPU为平均灌注单位；处理因素主效应，F=2.86，P=0.104；时间因素主效应，F=2.55，P=0.104；两者交互作用，F=8.81，P<0.001；F值、P值为组间各时间点总体比较所得；与0.1 μg/mL GO复合水凝胶组比较，aP<0.01，cP<0.05;与0.1 μg/mL GO复合水凝胶组治疗7 d比较，bP<0.05,dP<0.01 
7 4组小鼠全层皮肤缺损创面经GO-GelMA复合水凝胶治疗各时间点血流灌注情况。7A、7B、7C.分别为治疗3 d时0 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组创面血流灌注情况；7D、7E、7F.分别为0.1 μg/mL GO复合水凝胶组治疗3、7、14 d 创面血流灌注情况，随着治疗时间延长，血流灌注逐渐减少，但图7D血流灌注明显高于图7A、7B、7C注：GO为氧化石墨烯，GelMA为甲基丙烯酸酐化明胶；黑色代表无血流灌注，绿色代表血流灌注少，红色代表血流灌注多2.4.3 创面组织病理学观察
2.4.3 .1 创面血管新生情况以及GO分布与新生血管的位置关系
治疗7 d，4组小鼠创面基底均有明显的血管新生，0 μg/mL GO复合水凝胶组、0.1 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面新生血管密度分别为每200倍视野下（61.7±1.3）、（120.7±4.1）、（77.7±10.2）、（99.0±7.9）根，组间总体比较，差异明显（F=28.08，P<0.001）。0.1 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面新生血管密度最大，明显高于0 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组（q值分别为12.88、7.79、6.70，P值分别为<0.001、0.003、0.006），1.0 μg/mL GO复合水凝胶组和5.0 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面新生血管密度均明显高于0 μg/mL GO复合水凝胶组（q值分别为5.10、6.19，P值分别为0.029、0.010），1.0 μg/mL GO复合水凝胶组和5.0 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面新生血管密度无明显差异（q=1.09，P=0.865）。治疗7 d，随着创面基底组织不断修复，0 μg/mL GO复合水凝胶组和0.1 μg/mL GO复合水凝胶组水凝胶敷料均逐渐降解，且相较于0 μg/mL GO复合水凝胶组，0.1 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面中可明显看到有成簇新生血管，且聚集于GO附近。见图8。
8 4组小鼠全层皮肤缺损创面经GO-GelMA复合水凝胶治疗7 d血管新生情况。8A、8B、8C、8D.分别为0 μg/mL GO复合水凝胶组、0.1 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组，均有血管生成 苏木精-伊红×200，图中标尺为100 μm；8E、8F.分别为0 μg/mL GO复合水凝胶组和0.1 μg/mL GO复合水凝胶组，0.1 μg/mL GO复合水凝胶组有成簇新生血管且集中分布于GO附近 苏木精-伊红×400，图中标尺为50 μm注：GO为氧化石墨烯，GelMA为甲基丙烯酸酐化明胶；黑色箭头指示GO2.4.3 .2 免疫组织化学染色检测创面细胞VEGF的表达
治疗7 d，相较于0 μg/mL GO复合水凝胶组，0.1 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面中GO和新生血管分布区域有大量VEGF表达。见图9。
9 2组小鼠全层皮肤缺损创面经GO-GelMA复合水凝胶治疗7 d时VEGF的表达 二氨基联苯胺-苏木精×400，图中标尺为50 μm。9A、9B.分别为0 μg/mL GO复合水凝胶组、0.1 μg/mL GO复合水凝胶组VEGF表达，0.1 μg/mL GO复合水凝胶组VEGF表达明显高于0 μg/mL GO复合水凝胶组注：VEGF阳性染色为深褐色；GO为氧化石墨烯，GelMA为甲基丙烯酸酐化明胶，VEGF为血管内皮生长因子；白色箭头指示的是GO3. 讨论
GelMA因为其良好的生物相容性和可调的物理特性，被广泛应用于各种生物医学领域，皮肤作为人体最大、最易触及的浅表器官，使得GelMA在其中的应用更为方便和广泛［25, 26］，但是单纯采用GelMA治疗创面无法促进创面床血管化。Vedakumari等［27］研究表明，GO可用于诱导鸡胚血管生成实验中的血管生成，治疗血管生成不足疾病，但是目前对于促进血管生成的GO浓度还存在争议，即不同的GO浓度可能会对血管生成起到不同的作用［21，28, 29］，而且缺乏GO创面血管化的体外研究，因此本研究制备GO-GelMA复合水凝胶敷料并对其促进小鼠全层皮肤缺损创面的血管化效果进行初探。
首先，本课题组通过场发射扫描电子显微镜观察到GO为多层片状结构，宽度约为20 μm、长度约为50 μm。本课题组接着研究了GO对HSF增殖活性的影响，结果显示GO质量浓度为10.0 μg/mL时会对细胞增殖活性有明显抑制作用，可能是因为GO通过促进细胞产生较多线粒体活性氧自由基，从而诱导细胞死亡［30］，因而后续实验研究排除使用10.0 μg/mL的GO。随后，本研究进行划痕试验，结果显示GO质量浓度为0.1 μg/mL时能够促进HSF和HUVEC迁移；ELISA实验结果显示，GO质量浓度为0.1 μg/mL时能促进HSF分泌VEGF。总之，细胞实验表明GO质量浓度为0.1 μg/mL时，对细胞的增殖、迁移和分泌VEGF均具有明显的促进作用，而1.0、5.0 μg/mL的GO对HSF没有细胞毒性，同时对HSF增殖活性没有明显影响。
然后，本研究制备含GO质量浓度分别为0、0.1、1.0、5.0 μg/mL的GO-GelMA复合水凝胶，白光照射2 min后4组水凝胶均能成功交联固化，形成微黄色凝胶状水凝胶敷料，说明加入GO后不会影响GelMA交联。研究表明，加入低于5.0 μg/mL的GO后GelMA水凝胶的黏度、杨氏模量等物理性能与单纯GelMA水凝胶相近［31］，因此含不同质量浓度GO的GO-GelMA复合水凝胶敷料的生物学效应的差异主要归因于GO浓度。本研究检测了复合水凝胶中GO的释放，结果显示，至7 d时包裹在不同复合水凝胶中的GO全部释放。
本研究接着将制备的含不同质量浓度GO的GO-GelMA复合水凝胶敷料用于治疗小鼠背部全层皮肤缺损创面，但4组小鼠治疗各时间点创面愈合率比较，差异无统计学意义（P>0.05），说明含不同质量浓度GO的GO-GelMA复合水凝胶敷料对创面愈合的效果相近。但创面血流灌注的检测显示，0.1 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面治疗3 d的MPU比值明显高于其他3组；0.1 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面MPU比值在治疗3 d达到峰值，随后逐渐下降。创面修复过程主要包括3个阶段：炎症期、新组织生成期和重塑期，小鼠背部创面的新组织生成期为伤后2~10 d，血管生成主要发生在这一阶段［32, 33, 34］。本部分实验结果表明，0.1 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面治疗7 d，即在新组织生成期的新生血管密度增加，而进入创面重塑期后GO不会继续增加创面新生血管的密度，即含0.1 μg/mL GO的GO-GelMA复合水凝胶可以在新组织生成期显著促进创面血管化而不会对重塑期的创面血管化产生影响。Ridiandries等［35］研究表明，如果重塑期血管生成和细胞增殖过程不停止，可能会导致瘢痕形成。因此，本研究团队认为，含0.1 μg/mL GO的GO-GelMA复合水凝胶能够对创面血管化有较好的促进作用。
最后，本研究对创面组织进行HE染色，结果显示，随着创面修复的进展，治疗7 d时含0.1 μg/mL GO的GO-GelMA复合水凝胶有明显的新生血管富集现象，说明其可促进创面血管化。免疫组织化学染色显示，GO周围区域有大量VEGF表达。多项研究显示，GO诱导的细胞内活性氧自由基（包括一氧化氮）升高会诱导多种生长因子（如VEGF和碱性FGF等）的信号转导级联反应［36, 37, 38, 39］。研究表明，牛血清白蛋白包被的GO可以显著吸附VEGF，分子动力学模拟实验表明GO对蛋白的吸附作用可能是由蛋白质中氨基酸残基和GO的官能团之间的静电相互作用驱动的［40, 41, 42, 43］，提示GO促进血管生成可能是通过促进细胞分泌VEGF且VEGF在局部富集而实现的。
综上所述，含0.1 μg/mL GO的GO-GelMA复合水凝胶能明显促进HSF和HUVEC迁移以及HSF增殖和分泌VEGF。在不影响创面愈合率的情况下，含0.1 μg/mL GO的GO-GelMA复合水凝胶在创面愈合的组织生成期能明显增加血流灌注，其中的GO有促进血管生成的作用，GO富集新生血管的作用有可能是通过增加创面VEGF分泌来实现的。然而含GO的GO-GelMA复合水凝胶促进创面血管化的作用机制仍需要深入研究。基于此，GO-GelMA生物墨水在再生医学领域具有广阔的应用前景。
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与细胞外基质具有超亲和力的生物工程化因子血管内皮生长因子A和血小板衍生生长因子BB及肝素结合表皮生长因子的三联疗法可促进1型糖尿病小鼠的创面愈合
梁莉婷：设计实验、实施研究、采集数据、分析/解释数据、文章撰写；宋薇、李曌、姚斌：对文章的知识性内容作批评性审阅、技术和材料支持；张超、张孟德、袁星宇、恩和吉日嘎拉：实施研究、采集数据、解释数据、统计分析；付小兵、黄沙、朱平：酝酿和设计实验、研究过程指导、研究经费支持、对文章的知识性内容作批评性审阅所有作者均声明不存在利益冲突糖尿病引起的慢性难愈合创面会导致患者生活质量下降、感染乃至截肢，而这类创面的治疗方式的选择有限。该研究团队曾利用胎盘生长因子-2123-144（PIGF-2123-144）的肝素结合域设计生长因子，使得其与创面环境中暴露的ECM结合。在1型糖尿病小鼠模型中，工程生长因子（eGF）可促进创面再上皮化和肉芽组织形成。联合使用eGF则更为有效，如联合血管内皮生长因子A（VEGF-A）与PIGF-2123-144形成的VEGF-A-PIGF-2123-144、血小板衍生生长因子BB（PDGF-BB）与PIGF-2123-144形成的PDGF-BB-PIGF-2123-144和肝素结合EGF（HB-EGF）与PIGF-2123-144形成的HB-EGF-PIGF-2123-144的“三联疗法”可显著促进创面愈合，其在给药部位停留的时间明显长于野生型生长因子。此外，该研究团队还观察到，在1型糖尿病小鼠模型中创面的细胞环境的变化，包括M1型巨噬细胞、M2型巨噬细胞和效应T细胞的数量变化，对创面愈合情况有显著预测价值。这些结果提示，VEGF-A-PIGF-2123-144与PDGF-BB-PIGF-2123-144和HB-EGF-PIGF-2123-144的三联疗法可能是促进糖尿病慢性难愈合溃疡愈合的一种有效治疗手段。张凡，编译自《NPJ Regen Med》，2021,6(1):76；肖健，审校 -
参考文献
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2 细胞计数试剂盒8法检测5组人皮肤成纤维细胞培养48 h后的吸光度值 (样本数为6，
注：以吸光度值表示细胞增殖活性；GO为氧化石墨烯；横坐标下方1、2、3、4、5分别为0 μg/mL GO组、0.1 μg/mL GO组、1.0 μg/mL GO组、5.0 μg/mL GO组、10.0 μg/mL GO组；5组细胞吸光度值总体比较，F=17.16，P<0.001；与0 μg/mL GO组比较，aP<0.01
3 划痕试验观察4组人皮肤成纤维细胞划痕后36 h的迁移情况 倒置荧光显微镜×50，图中标尺为500 μm。3A、3B、3C、3D.分别为0 μg/mL GO组、0.1 μg/mL GO组、1.0 μg/mL GO组、5.0 μg/mL GO组细胞迁移情况，图3B剩余划痕面积最小，图3A、3C、3D剩余划痕面积相近且均明显大于图3B
注：GO为氧化石墨烯
4 划痕试验观察4组人脐静脉血管内皮细胞划痕后12 h的迁移情况 倒置荧光显微镜×50，图中标尺为500 μm。4A、4B、4C、4D.分别为0 μg/mL GO组、0.1 μg/mL GO组、1.0 μg/mL GO组、5.0 μg/mL GO组细胞迁移情况，图4B剩余划痕面积最小，图4A、4C、4D剩余划痕面积相似且均大于图4B
注：GO为氧化石墨烯
5 4组GO-GelMA复合水凝胶交联前后性状。5A、5B、5C、5D.分别为交联前0 μg/mL GO复合水凝胶组、0.1 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组，均为红色液体状；5E、5F、5G、5H.分别为交联后0 μg/mL GO复合水凝胶组、0.1 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组，均为微黄色凝胶状，且5.0 μg/mL GO复合水凝胶组颜色最深，4组流动性无明显差别
注：GO为氧化石墨烯，GelMA为甲基丙烯酸酐化明胶
6 4组小鼠全层皮肤缺损创面经GO-GelMA复合水凝胶治疗各时间点愈合情况。6A、6B、6C、6D.分别为治疗3 d时0 μg/mL GO复合水凝胶组、0.1 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组，创面均不同程度缩小；6E、6F、6G、6H.分别为治疗14 d 时0 μg/mL GO复合水凝胶组、0.1 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组，创面均基本愈合，且均未见水凝胶敷料残留
注：GO为氧化石墨烯，GelMA为甲基丙烯酸酐化明胶
7 4组小鼠全层皮肤缺损创面经GO-GelMA复合水凝胶治疗各时间点血流灌注情况。7A、7B、7C.分别为治疗3 d时0 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组创面血流灌注情况；7D、7E、7F.分别为0.1 μg/mL GO复合水凝胶组治疗3、7、14 d 创面血流灌注情况，随着治疗时间延长，血流灌注逐渐减少，但图7D血流灌注明显高于图7A、7B、7C
注：GO为氧化石墨烯，GelMA为甲基丙烯酸酐化明胶；黑色代表无血流灌注，绿色代表血流灌注少，红色代表血流灌注多
8 4组小鼠全层皮肤缺损创面经GO-GelMA复合水凝胶治疗7 d血管新生情况。8A、8B、8C、8D.分别为0 μg/mL GO复合水凝胶组、0.1 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组，均有血管生成 苏木精-伊红×200，图中标尺为100 μm；8E、8F.分别为0 μg/mL GO复合水凝胶组和0.1 μg/mL GO复合水凝胶组，0.1 μg/mL GO复合水凝胶组有成簇新生血管且集中分布于GO附近 苏木精-伊红×400，图中标尺为50 μm
注：GO为氧化石墨烯，GelMA为甲基丙烯酸酐化明胶；黑色箭头指示GO
9 2组小鼠全层皮肤缺损创面经GO-GelMA复合水凝胶治疗7 d时VEGF的表达 二氨基联苯胺-苏木精×400，图中标尺为50 μm。9A、9B.分别为0 μg/mL GO复合水凝胶组、0.1 μg/mL GO复合水凝胶组VEGF表达，0.1 μg/mL GO复合水凝胶组VEGF表达明显高于0 μg/mL GO复合水凝胶组
注：VEGF阳性染色为深褐色；GO为氧化石墨烯，GelMA为甲基丙烯酸酐化明胶，VEGF为血管内皮生长因子；白色箭头指示的是GO
表1 4组人皮肤成纤维细胞划痕后各时间点细胞迁移率比较（%，
组别 样本数 24 h 36 h 0 μg/mL GO组 5 23.5±7.7 55.0±7.2a 0.1 μg/mL GO组 5 30.1±1.1 82.2±13.9 1.0 μg/mL GO组 5 19.1±6.9 42.8±2.6a 5.0 μg/mL GO组 5 19.1±8.9 45.1±9.5a F值 2.85 19.08 P值 0.070 <0.001 注：GO为氧化石墨烯；处理因素主效应，F=1.97，P=0.159；时间因素主效应，F=441.00，P<0.001；两者交互作用，F=0.71，P=0.641；F值、P值为组间各时间点总体比较所得；与0.1 μg/mL GO组比较， aP<0.01 
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表2 4组人皮肤成纤维细胞培养各时间点血管内皮生长因子的表达比较（
组别 样本数 4 h 6 h 8 h 0 μg/mL GO组 3 17.90±0.89 17.14±0.92 17.11±1.28a 0.1 μg/mL GO组 3 17.72±0.45 19.62±1.64 19.56±0.51 1.0 μg/mL GO组 3 16.98±0.53 17.31±1.21 17.76±0.86 5.0 μg/mL GO组 3 16.78±0.59 17.07±0.08 17.25±0.60a F值 2.25 3.61 5.11 P值 0.159 0.065 0.029 注：GO为氧化石墨烯；处理因素主效应，F=8.52，P<0.001；时间因素主效应，F=1.35，P=0.279；两者交互作用，F=1.52，P=0.215；F值、P值为组间各时间点总体比较所得；与0.1 μg/mL GO组比较，aP<0.05
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表3 4组小鼠全层皮肤缺损创面经GO-GelMA复合水凝胶治疗各时间点创面愈合率比较（%，
组别 样本数 3 d 7 d 14 d 0 μg/mL GO复合水凝胶组 3 22.1±5.5 66.5±8.8 97.1±2.0 0.1 μg/mL GO复合水凝胶组 3 30.8±7.9 66.5±4.9 94.5±1.4 1.0 μg/mL GO复合水凝胶组 3 30.8±9.6 72.4±5.7 97.3±1.0 5.0 μg/mL GO复合水凝胶组 3 33.3±6.4 70.3±4.5 97.8±1.0 F值 1.32 0.89 5.77 P值 0.316 0.434 0.062 注：GO为氧化石墨烯，GelMA为甲基丙烯酸酐化明胶；处理因素主效应，F=2.89，P=0.068；时间因素主效应，F=656.20，P<0.001；两者交互作用，F=1.06，P=0.405；F值、P值为组间各时间点总体比较所得
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表4 4组小鼠全层皮肤缺损创面经GO-GelMA复合水凝胶治疗各时间点MPU比值比较 （
组别 样本数 3 d 7 d 14 d 0 μg/mL GO复合水凝胶组 3 1.77±0.11a 1.29±0.16 1.85±0.22 0.1 μg/mL GO复合水凝胶组 3 2.68±0.16b 2.13±0.24 1.46±0.24d 1.0 μg/mL GO复合水凝胶组 3 1.80±0.08c 1.74±0.17 2.45±0.56 5.0 μg/mL GO复合水凝胶组 3 1.82±0.11a 1.87±0.30 1.75±0.36 F值 30.22 7.83 3.07 P值 0.011 0.093 0.201 注：GO为氧化石墨烯，GelMA为甲基丙烯酸酐化明胶，MPU为平均灌注单位；处理因素主效应，F=2.86，P=0.104；时间因素主效应，F=2.55，P=0.104；两者交互作用，F=8.81，P<0.001；F值、P值为组间各时间点总体比较所得；与0.1 μg/mL GO复合水凝胶组比较，aP<0.01，cP<0.05;与0.1 μg/mL GO复合水凝胶组治疗7 d比较，bP<0.05,dP<0.01
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