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, 最新更新时间 , doi: 10.3760/cma.j.cn501225-20260107-00013
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目的 探讨皮肤类器官来源细胞外囊泡（SOEV）复合水凝胶对小鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响。 方法 该研究为成组设计和重复测量设计实验研究。取HaCaT细胞、人皮肤成纤维细胞与人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）,按2∶1∶1的数量比混合后于6孔超低吸附培养板中进行三维培养以制备皮肤类器官,观察培养1、3、7、14 d皮肤类器官形成情况。培养7 d,采用免疫荧光法检测皮肤类器官中表皮标志物细胞角蛋白14（CK14）、血管标志物CD31、真皮标志物波形蛋白的表达。培养7 d,采用顺序差速超速离心法从皮肤类器官培养上清液中分离提取SOEV,采用透射电子显微镜观察SOEV超微结构,采用纳米颗粒跟踪分析仪检测SOEV粒径。取HaCaT细胞和HUVEC,将2种细胞都分为加入30 μg/mL SOEV培养的SOEV组和常规培养的对照组,行划痕试验,计算划痕后24 h即培养24 h细胞的迁移率（样本数为6）。制备甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）水凝胶和含30 μg/mL SOEV的GelMA水凝胶（即SOEV复合水凝胶）。取18只6周龄雄性C57BL/6J小鼠,采用随机数字表法分为对照组、GelMA组和SOEV@GelMA组（每组6只小鼠）,在所有小鼠背部造成1个全层皮肤缺损创面,伤后0 d（即刻）,分别于对照组、GelMA组、SOEV@GelMA组小鼠创面施加磷酸盐缓冲液、GelMA水凝胶、SOEV复合水凝胶。观察伤后0、3、7、10、14 d创面愈合情况并计算伤后3、7、10、14 d创面愈合率；伤后14 d,取创面组织,行苏木精-伊红染色观察创面上皮再生程度,行Masson染色观察创面胶原纤维沉积情况并计算胶原纤维阳性面积占比。 结果 培养1~14 d,皮肤类器官逐渐成熟,结构逐渐紧缩致密,球体边界清晰。培养7 d,皮肤类器官表达CK14、CD31及波形蛋白。从培养7 d皮肤类器官培养上清液中提取的SOEV呈现典型的盘状囊泡样结构,平均粒径为70.1 nm。划痕后24 h,SOEV组HaCaT细胞、HUVEC的迁移率均明显高于相应的对照组（t值分别为16.73、7.71,P<0.05）。伤后0~14 d,3组小鼠创面面积均逐渐减小。伤后3、7、10、14 d,SOEV@GelMA组小鼠创面愈合率分别为（56.47±9.26）%、（73.87±6.02）%、（92.62±3.92）%、（98.92±0.26）%,均明显高于对照组的（28.18±15.63）%、（49.21±11.96）%、（72.53±7.93）%、（86.73±2.34）%（P<0.05）；伤后3、7、10 d,SOEV@GelMA组小鼠创面愈合率均明显高于GelMA组[（34.51±14.43）%、（58.30±8.00）%、（79.16±4.15）%,P<0.05]。伤后14 d,GelMA组与SOEV@GelMA组小鼠创面新生上皮覆盖范围均大于对照组；GelMA组与对照组小鼠部分创面仍存在表皮与真皮分离现象,而SOEV@GelMA组小鼠创面已基本实现再上皮化。伤后14 d,3组小鼠创面组织中均可见胶原纤维沉积,其中SOEV@GelMA组小鼠创面组织中胶原纤维在真皮层中排列较为整齐；GelMA组与SOEV@GelMA组小鼠创面组织中胶原纤维阳性面积占比均明显高于对照组（P<0.05）,SOEV@GelMA组小鼠创面组织中胶原纤维阳性面积占比明显高于GelMA组（P<0.05）。 结论 SOEV复合水凝胶能够促进小鼠全层皮肤缺损创面胶原纤维沉积并加速创面修复进程,显著提升愈合疗效,改善愈合质量。
, 最新更新时间 , doi: 10.3760/cma.j.cn501225-20260205-00074
摘要:
目的 建立一种基于人诱导多能干细胞（hiPSC）的三维皮肤类器官构建体系。 方法 该研究为基础实验研究。取华中科技大学同济医学院收治的1名45岁、男性患者植发手术过程中遗弃的毛囊组织,获取人原代皮肤成纤维细胞。将人原代皮肤成纤维细胞诱导为hiPSC,并培养形成三维聚集体。然后进行如下诱导分化过程：分化第0天（启动分化当天）,将三维聚集体转移至低粘附培养板中,在添加基质胶、抑制剂SB431542、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）及骨形态发生蛋白-4的E6培养基中培养,诱导非神经外胚层形成；分化第3天,在原培养基的基础上补充1/4原体积的含抑制剂LDN193189和bFGF的E6培养基,继续培养,诱导颅神经嵴细胞形成；分化第6天,在原培养基的基础上补充约1/3原体积的单纯E6培养基,继续培养；分化第8天和第10天分别进行半量换液后继续培养；分化第12天,将细胞团块接种于低粘附培养板中,加入含基质胶的类器官成熟培养基,诱导表皮自组装；分化第15天,进行半量换液后继续培养；分化第18天,将原培养基更换为添加α-黑色素细胞刺激素的类器官成熟培养基,继续培养；自分化第21天起,每3天半量换液一次,继续培养。分化启动后,每天观察hiPSC向皮肤类器官分化的阶段性形态特征。采用免疫荧光法于分化第12、20、35、55、75、90天分别鉴定皮肤类器官的间充质细胞情况、表皮终末分化情况、间充质及上皮结构形成情况、毛囊干细胞及基底层角质形成细胞相关特征情况、真皮乳头形成情况及毛芽样结构形成情况、类器官增殖活性。采用组织化学法,鉴定分化第110天,皮肤类器官的毛囊形成情况及脂质沉积与皮脂腺样结构形成情况。 结果 分化第0天,hiPSC形成的三维聚集体边界清晰、大小均匀；分化第3天,聚集体表面出现外胚层样结构,伴非上皮样细胞开始外迁；分化第6~8天,聚集体中的间充质细胞及神经胶质样细胞逐渐增多；分化第12~18天,聚集体中形成具有空间异质性的类器官,出现初步的表皮-真皮样双层结构；分化第60天,可见毛芽样结构形成；分化第80~130天,逐渐出现更成熟的毛芽样结构和毛囊样结构。免疫荧光法检测显示,分化第12天,类器官周围可见早期间充质细胞。分化第20天,类器官外层出现角质形成细胞。分化第35天,类器官中出现真皮样细胞,并与上皮结构形成明显空间分区；同时存在基底层样细胞群。分化第55天,检测到真皮乳头样细胞群,其与表皮区域呈空间邻近分布。分化第75天,类器官局部可见向内生长的增厚上皮结构,并伴有细胞聚集形成毛芽样结构；毛芽邻近区域可检测到真皮乳头样细胞群,与上皮结构呈空间邻近分布。分化第90天,毛芽区域可见增殖细胞富集。组织化学法检测显示,至分化第110天,类器官中可见更成熟的毛囊样结构、毛干样突起、脂质沉积及皮脂腺样结构形成。 结论 本研究成功构建了一种基于hiPSC的三维皮肤类器官体系。通过阶段性调控关键信号通路,在体外重建了具有毛囊样结构的复杂皮肤组织模型。该体系的诱导分化过程高度模拟了人体内皮肤及毛囊的发育程序,为研究人皮肤发生机制及其在再生医学中的应用,提供了可靠的体外模型。
, 最新更新时间 , doi: 10.3760/cma.j.cn501225-20260105-00005
摘要:
目的 探讨西兰花来源细胞外囊泡（BEV）对糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响及其机制。 方法 该研究为成组设计及重复测量设计实验研究。采用超滤浓缩联合尺寸排阻层析法分离提纯BEV并成功鉴定。采用随机数字表法将小鼠RAW264.7细胞分为常规培养的对照组,以及均经内毒素/脂多糖（LPS）刺激12 h后分别行常规培养、加入BEV培养的LPS组、BEV组。培养24 h后,采用蛋白质印迹法检测细胞中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和精氨酸酶-1（Arg-1）的蛋白表达,采用免疫荧光法检测细胞中CD86和CD206的蛋白表达,采用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯荧光探针法检测细胞中活性氧水平,采用实时荧光定量反转录PCR法检测细胞中核转录因子红系2相关因子2（Nrf2）和血红素加氧酶-1（HO-1）的mRNA表达,上述实验样本数均为3。取24只7周龄雄性db/db小鼠,在其背部制作1个全层皮肤缺损创面后按随机数字表法分为对照组和BEV组,每组12只。伤后0（即刻）、3、6、9 d,分别在对照组、BEV组小鼠创面局部注射生理盐水、1×1010个/mL BEV溶液。伤后0、3、6、9、12 d观察创面愈合情况,计算伤后3、6、9、12 d创面愈合率。伤后6 d,采用免疫荧光法检测创面组织中CD86和CD206阳性面积占比,采用二氢乙锭荧光探针法检测创面组织中活性氧水平。 结果 培养24 h后,与对照组相比,LPS组细胞中iNOS和CD86的蛋白表达均显著升高（P<0.05）,活性氧水平显著升高（P<0.05）；与LPS组相比,BEV组细胞中iNOS和CD86的蛋白表达均显著降低（P<0.05）,Arg-1和CD206的蛋白表达均显著升高（P<0.05）,活性氧水平显著降低（P<0.05）,Nrf2及HO-1的mRNA表达均显著升高（P<0.05）。伤后0~12 d,对照组和BEV组小鼠创面均逐渐愈合,其中伤后3、6、9、12 d,BEV组小鼠创面愈合率均显著高于对照组（t值分别为5.98、5.79、7.40、8.67,P<0.05）。伤后6 d,BEV组小鼠创面组织中CD86阳性面积占比为（0.60±0.29）%,较对照组的（1.61±0.19）%显著降低（t=7.20,P<0.05）；BEV组小鼠创面组织中CD206阳性面积占比为（3.42±0.77）%,较对照组的（0.66±0.20）%显著升高（t=8.48,P<0.05）；BEV组小鼠创面组织中活性氧水平较对照组显著降低（t=8.38,P<0.05）。 结论 BEV可通过激活Nrf2/HO-1轴,诱导巨噬细胞由M1型向M2型极化并降低活性氧水平,恢复糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面“免疫-氧化”稳态,从而显著加速创面愈合进程。
, 最新更新时间 , doi: 10.3760/cma.j.cn501225-20251118-00473
摘要:
目的 探讨中性粒细胞中CD177水平与CD10水平的比值（以下简称CD177/CD10比）在烧伤患者感染风险预测中的价值,并建立其正常参考值范围。 方法 该研究为横断面研究。2023年2月—2025年11月,南京医科大学附属苏州医院收治61例符合入选标准的烧伤患者,其中男52例、女9例,年龄41.0（32.0,55.0）岁,其中59例患者进行了伤后1 d急性应激期炎症指标监测,48例患者进行了伤后3~14 d感染高风险期炎症指标监测（以下简称高风险期监测）；同期招募于该单位体检中心体检结果正常的204名健康志愿者,其中男110人、女94人,年龄47.5（31.0,67.0）岁。利用流式细胞术监测烧伤患者伤后1、3、5、7、10、14 d和健康志愿者的中性粒细胞中CD177和CD10的水平。根据是否发生感染,将行高风险期监测的患者分为感染组（31例）和非感染组（17例）,比较2组患者入院时烧伤总面积等一般资料,白细胞计数、中性粒细胞计数、中性粒细胞百分比、C反应蛋白水平、降钙素原水平、CD177水平、CD10水平、CD177/CD10比等炎症指标,以及序贯器官衰竭评估（SOFA）评分,筛选影响行高风险期监测的患者发生感染的危险因素,其中感染组患者取确诊感染前最近一次的检测数据,非感染组患者取伤后3~14 d检测的最高值进行分析（选取数据后同）。采用受试者操作特征（ROC）曲线,评估前述炎症指标及SOFA评分对行高风险期监测的患者感染风险的预测效能。分析行高风险期监测的患者CD177水平与CD10水平的相关性,比较健康志愿者、烧伤患者急性应激期及感染高风险期CD177水平、CD10水平与CD177/CD10比。基于健康志愿者数据,采用非参数百分位数法建立CD177/CD10比的正常参考值范围。 结果 感染组与非感染组患者在烧伤总面积、C反应蛋白水平、SOFA评分、CD177水平、CD10水平、CD177/CD10比方面比较,差异均有统计学意义（Z值分别为-2.08、-2.58、0.04、-2.72、-2.86、-3.20,P<0.05）。单因素logistic回归分析结果显示,烧伤总面积和lg（CD177/CD10比）均是行高风险期监测的患者发生感染的危险因素（OR值分别为1.03、6.91,95%CI分别为1.00~1.06、1.84~25.91,P<0.05）；多因素logistic回归分析结果显示,lg（CD177/CD10比）是行高风险期监测的患者发生感染的独立危险因素（OR=5.73,95%CI为1.11~29.60,P<0.05）。ROC曲线分析显示,CD177/CD10比预测行高风险期监测的患者感染风险的曲线下面积最大,为0.78（95%CI为0.65~0.91）,其最佳截断值为3.84,最佳截断值下的敏感度、特异度、准确度、阳性预测值、阴性预测值分别为58.06%、94.12%、76.09%、94.74%、55.17%。在行高风险期监测的患者中,CD177水平与CD10水平呈显著负相关（r=-0.60,P<0.05）。与健康志愿者、烧伤患者急性应激期比较,烧伤患者感染高风险期CD10水平显著降低（P值均<0.05）,CD177水平与CD177/CD10比均显著升高（P<0.05）。建立的CD177/CD10比的正常参考值范围为0~0.64。 结论 中性粒细胞中CD177/CD10比对烧伤患者感染风险具有一定的预测价值,预测价值高于白细胞计数、中性粒细胞计数、中性粒细胞百分比、C反应蛋白水平、降钙素原水平和SOFA评分。建立的CD177/CD10比的正常参考值范围为0~0.64。
