Effects of trehalose gel on full-thickness skin defect wounds in rats and scar hyperplasia in rabbit ears
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摘要:
目的 探讨海藻糖凝胶对大鼠全层皮肤缺损创面及兔耳瘢痕增生的影响。 方法 该研究为实验研究。制备海藻糖凝胶和卡波姆凝胶,辐照灭菌后观察其外观并检测其粘度、成模率、阻菌率、重金属含量、保湿率、水蒸气透过率、无菌性等理化特性和细胞毒性、皮内刺激、致敏性等生物相容性。取30只8~10周龄雄性SD大鼠,按照随机数字表法分为实验组、阳性对照组、阴性对照组,每组10只。在阴性对照组、阳性对照组、实验组大鼠背部制备全层皮肤缺损创面模型,分别进行常规换药、卡波姆凝胶换药、海藻糖凝胶换药处理。统计伤后6、12 d创面愈合率并记录创面愈合时间。伤后6 d,采用透射电镜观测大鼠创面组织中自噬体和自噬溶酶体数量,采用酶联免疫吸附测定法检测大鼠创面组织中微管相关蛋白轻链3Ⅰ（LC3Ⅰ）和LC3Ⅱ含量并计算其比值,采用天狼星红-苦味酸染色法检测大鼠创面组织中Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白占比及其比值和总胶原蛋白占比。前述实验样本数均为5。取3只3~4个月龄雄性新西兰白化模型兔,在每侧兔耳各制备3个深达软骨膜的创面,同前进行分组和处理,每组6个创面。创面愈合后30 d,大体观察并使用温哥华瘢痕量表评估兔耳瘢痕情况,采用苏木精-伊红染色检测兔耳瘢痕组织中表皮和真皮的厚度,采用天狼星红-苦味酸染色检测兔耳瘢痕组织中Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白占比及其比值和总胶原蛋白占比及其排布情况。样本数为6。 结果 辐照后的海藻糖凝胶和卡波姆凝胶均呈淡黄色透明状,无异味和杂质。海藻糖凝胶粘度、成膜率、阻菌率、保湿率均显著优于卡波姆凝胶（t值分别为4.13、3.50、4.03、5.80,P<0.05）,但水蒸气透过率显著低于卡波姆凝胶（t=-4.14,P<0.05）。2种凝胶均未检出重金属和细菌。2种凝胶均无细胞毒性,皮内刺激和致敏性均为阴性。伤后6、12 d,阳性对照组大鼠创面愈合率均明显高于阴性对照组（t值分别为-6.82和-4.58,P<0.05）,实验组大鼠创面愈合率均明显高于阳性对照组（t值分别为-8.90和-4.25,P<0.05）和阴性对照组（t值分别为-8.78和-4.25,P<0.05）。阳性对照组和实验组大鼠创面愈合时间分别为（20.4±2.5）、（23.4±2.5）d,均明显短于阴性对照组的（27.0±2.1）d（t值分别为2.45、-4.49,P<0.05）。伤后6 d,实验组大鼠创面组织中自噬体和自噬溶酶体数量均显著多于阳性对照组（t值分别为7.37和9.33,P<0.05）和阴性对照组（t值分别为-7.06和-8.54,P<0.05）。伤后6 d,阳性对照组大鼠创面组织中LC3Ⅱ含量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均显著高于阴性对照组（t值分别为-4.48和-2.47,P<0.05）；实验组大鼠创面组织中LC3Ⅱ含量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均显著高于阴性对照组（t值分别为11.98和6.04,P<0.05）和阳性对照组（t值分别为-6.64和-4.17,P<0.05）,LC3Ⅰ含量明显低于阴性对照组（t=2.33,P<0.05）。伤后6 d,3组大鼠创面组织中总胶原蛋白和Ⅰ型胶原蛋白占比均相近,P>0.05。伤后6 d,阳性对照组大鼠创面组织中Ⅲ型胶原蛋白占比显著高于阴性对照组（t=-3.19,P<0.05）,且Ⅰ型胶原蛋白/Ⅲ型胶原蛋白显著低于阴性对照组（t=2.18,P<0.05）；实验组大鼠创面组织中Ⅲ型胶原蛋白占比显著高于阴性对照组和阳性对照组（t值分别为-2.38和5.91,P<0.05）,且Ⅰ型胶原蛋白/Ⅲ型胶原蛋白显著低于阴性对照组和阳性对照组（t值分别为3.08和-4.35,P<0.05）。创面愈合后30 d,可观察到阳性对照组兔耳瘢痕增生情况与阴性对照组相近,而实验组兔耳瘢痕增生情况明显减轻。创面愈合后30 d,实验组兔耳瘢痕色泽、血管、厚度、硬度评分及总分均明显低于阳性对照组（t值分别为3.80、3.80、2.39、2.71、4.84,P<0.05）和阴性对照组（t值分别为-3.81、-4.78、0.04、-2.71、-5.14,P<0.05）。创面愈合后30 d,实验组、阴性对照组和阳性对照组兔耳瘢痕组织中表皮厚度相近（P>0.05）；阳性对照组兔耳瘢痕组织真皮厚度明显小于阴性对照组（t=5.42,P<0.05）,实验组兔耳瘢痕组织真皮厚度明显小于阴性对照组和阳性对照组（t值分别为11.91和8.49,P<0.05）。创面愈合后30 d,3组兔耳瘢痕组织中胶原蛋白排列均紊乱,总胶原蛋白占比相近（P>0.05）；实验组兔耳瘢痕组织中Ⅰ型胶原蛋白占比明显低于阳性对照组（t值分别为3.00,P<0.05）,Ⅲ型胶原蛋白占比明显高于阴性对照组和阳性对照组（t值分别为-4.46和4.05,P值均<0.05）,Ⅰ型胶原蛋白/Ⅲ型胶原蛋白明显低于阴性对照组和阳性对照组（t值分别为8.50和-5.25,P值均<0.05）。 结论 海藻糖凝胶相较于卡波姆凝胶具有更适于创面愈合的理化特性,且生物相容性良好；能基于自噬激活作用促进大鼠全层皮肤缺损创面愈合,减轻兔耳瘢痕增生。 Abstract:Objective To investigate the effects of trehalose gel on full-thickness skin defect wounds in rats and scar hyperplasia in rabbit ears. Methods The study was an experimental study. The trehalose gel and carbomer gel were prepared, their appearance after irradiation sterilization, and their physicochemical characterization such as viscosity, film forming rate, bacteria resistance rate, heavy metal content, moisture retention rate, water vapor permeability, sterility, and biocompatibility such as cytotoxicity, intradermal irritation, and sensitization were observed. Thirty male Sprague-Dawley rats aged 8-10 weeks were divided into experimental group, positive control group, and negative control group using a random number table method, with 10 rats in each group. The full-thickness skin defect wound models were prepared on the back of rats in negative control group, positive control group, and experimental group, and were treated with routine dressing change, carbomer gel dressing change, and trehalose gel dressing change, respectively. The wound healing rates on 6 and 12 days after injury and the wound healing time were recorded. On 6 days after injury, the number of autophagosomes and autophagolysosomes in rat wound tissue was detected using transmission electron microscopy. The content of microtubule associated protein light chain 3Ⅰ (LC3Ⅰ) and LC3Ⅱ in rat wound tissue was detected using enzyme-linked immunosorbent assay method and their ratio was calculated. The proportion of type Ⅰ and Ⅲ collagens and their ratio, as well as the total collagen proportion in rat wound tissue were detected using sirius red picric acid staining method. The number of samples in the aforementioned experiments was all 5. Three male New Zealand albino model rabbits aged 3-4 months were taken, and 3 wounds deep to the perichondrium were created on each of the rabbit ears, with six wounds in each group and being grouped and treated as mentioned above. On 30 days after wound healing, the scar tissue of the rabbit ear was observed and evaluated using the Vancouver scar scale. The thickness of the epidermis and dermis in the scar tissue of the rabbit ear was measured using hematoxylin eosin staining, and the proportion of type Ⅰ and Ⅲ collagens and their ratio, as well as the total collagen proportion and arrangement in the scar tissue of the rabbit ear were measured using sirius red picric acid staining method. The number of samples was 6. Results The irradiated trehalose gel and carbomer gel were light yellow and transparent, without odor and impurities. The viscosity, film forming rate, bacteria resistance rate, and moisture retention rate of trehalose gel were significantly better than that of carbomer gel (with t values of 4.13, 3.50, 4.03, and 5.80, respectively, P<0.05), but the water vapor permeability was significantly lower than that of carbomer gel (t=-4.14, P<0.05). No heavy metals or bacteria were detected in any gel. Both of the two gel had no cytotoxicity, and the intradermal irritation and sensitization were negative. On 6 and 12 days after injury, the wound healing rates of rats in positive control group were significantly higher than that in negative control group (with t values of -6.82 and -4.58, respectively, P<0.05); the wound healing rate of rats in experimental group was significantly higher than those in positive control group (with t values of -8.90 and -4.25, respectively, P<0.05) and negative control group (with t values of -8.78 and -4.25, respectively, P<0.05). The wound healing time ((20.4±2.5), (23.4±2.5) d) of rats in positive control group and experimental group was significantly shorter than (27.0±2.1) d in negative control group (with t values of 2.45 and -4.49, respectively, P<0.05). On 6 days after injury, the number of autophagosomes and autophagolysosomes in wound tissue in experimental group of rats were significantly higher than those in positive control group (with t values of 7.37 and 9.33, respectively, P<0.05) and negative control group (with t values of -7.06 and -8.54, respectively, P<0.05). On 6 days after injury, the content of LC3 Ⅱ and LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ in wound tissue in positive control group of rats were significantly higher than that in negative control group (with t values of -4.48 and -2.47, respectively, P<0.05); the content of LC3Ⅰ and LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ in wound tissue in experimental group of rats were significantly higher than those in negative control group (with t values of 11.98 and 6.04, respectively, P<0.05) and positive control group (with t values of -6.64 and -4.17, respectively, P<0.05), the content of LC3Ⅰ was significantly lower than that in negative control group (t=2.33, P<0.05). On 6 days after injury, the proportions of total collagen and type Ⅰ collagen in wound tissue of rats in the three groups were similar, P>0.05. On 6 days after injury, the proportion of type Ⅲ collagen in wound tissue of rats in positive control group was significantly higher than that in negative control group (t=-3.19, P<0.05), and the type Ⅰ collagen/type Ⅲ collagen was significantly lower than that in negative control group (t=2.18, P<0.05); the proportion of type Ⅲ collagen in the wound tissue of rats in experimental group was significantly higher than those in negative control group and positive control group (with t values of -2.38 and 5.91, respectively, P<0.05), and type Ⅰ collagen/type Ⅲ collagen was significantly lower than those in negative control group and positive control group (with t values of 3.08 and -4.35, respectively, P<0.05). On 30 days after wound healing, it was observed that the rabbit ear scar proliferation in positive control group was similar to that in negative control group, while the rabbit ear scar proliferation in experimental group was significantly reduced. On 30 days after wound healing, the color, blood vessels, thickness, hardness score, and total score of rabbit ear scars in experimental group were significantly lower than those in positive control group (with t values of 3.80, 3.80, 2.39, 2.71, and 4.84, respectively, P<0.05) and negative control group (with t values of -3.81, -4.78, 0.04, -2.71, and -5.14, respectively, P<0.05). On 30 days after wound healing, there was no significant difference in the epidermal thickness of rabbit ear scar tissue among experimental group, negative control group, and positive control group (P>0.05); the dermal thickness of rabbit ear scar tissue in positive control group was significantly smaller than that in negative control group (t=5.42, P<0.05), while the dermal thickness of rabbit ear scar tissue in experimental group was significantly smaller than those in negative control group and positive control group (with t values of 11.91 and 8.49, respectively, P<0.05). On 30 days after wound healing, the collagen protein arrangement of scar tissue of rabbits in the three groups was disordered, and the total collagen proportion was similar (P>0.05). The proportion of type Ⅰ collagen of scar tissue in experimental group was significantly lower than that in positive control group (t=3.00, P<0.05), the content of type Ⅲ collagen was significantly higher than those in negative control group and positive control group (with t values of -4.46 and 4.05, respectively, P<0.05), and the type Ⅰcollagen/type Ⅲ collagen was significantly lower than those in negative control group and positive control group (with t values of 8.50 and -5.25, respectively, P<0.05). Conclusions Compared with carbomer gel, trehalose gel has a more suitable physicochemical characterization for wound healing, and has good biocompatibility. It can promote the wound healing of full-thickness defects in rats and reduce scar hyperplasia in rabbit ears based on autophagy activation. -
Key words:
- Biocompatible materials /
- Trehalose /
- Cicatrix /
- Autophagy /
- Wound repair
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(1)以海藻糖为主要活性成分制备适用于创面的凝胶剂型,并对其与临床使用舒适度、安全性等相关的理化特性和生物相容性展开探索。
(2)以自噬为契入点,开展海藻糖凝胶对大鼠全层皮肤缺损创面及兔耳瘢痕增生影响的评估。
Highlights:
(1)With trehalose as the main active ingredient, a gel formulation suitable for wound application was prepared, and the physicochemical characterization and biocompatibility related to the comfort and safety of its clinical use were explored.
(2)Using autophagy as an entry point, we evaluated the effect of trehalose gel on full-thickness skin defect wounds in rats and scar hyperplasia in rabbit ears.
创面是日常生活中常见疾病,尤其是老龄化的进展导致压疮、糖尿病足等慢性创面的发病率逐年增长[1, 2, 3]。随着生活水平的提高,人们追求的创面治疗效果已不仅仅局限于创面闭合,对于愈合质量的关注越来越多,尤其是对瘢痕的预防[4, 5, 6]。
自噬是细胞自我保护的重要机制,涉及识别细胞内受损的蛋白质和/或细胞器[7, 8, 9]。适宜程度的自噬对创面愈合是有利的,能诱导创面细胞的自我修复,从而促进增殖、迁移等一系列病理生理活动,加速创面愈合[10, 11, 12]。通过增强创面细胞自噬活性来促进创面愈合的研究也成为近年来的热点。
海藻糖广泛存在于藻类、节肢动物等生物体内,是应激产物,用以维持这些生物在恶劣环境中的生存[13, 14, 15]。虽然人体自身无法合成海藻糖,但海藻糖含有的蛋白质、具有细胞保护作用的物质等生物活性成分使之成为酶、疫苗等生物制品以及精子、移植器官的保护剂[10,16]。海藻糖目前也已被证实与细胞和组织损伤后修复相关,如对肝脏缺血再灌注损伤[17]、紫外线照射和辐射损伤 [18]、低温烫伤[19]的细胞等具有修复作用。海藻糖的众多生物活性与其能增强细胞自噬作用相关,故本研究通过动物模型探索细胞自噬在海藻糖促进创面愈合中的作用。
1. 材料与方法
本实验研究遵循国家有关实验动物管理和使用的相关规定。
1.1 动物及主要材料来源
30只8~10周龄、体重180~220 g 的清洁级雄性SD大鼠与8只3~4个月龄、体重2 500~3 000 g的雄性新西兰白化模型兔及5只3~4个月龄、500~600 g的清洁级雄性豚鼠均购自海军军医大学实验中心,许可证号：SCXK〔Shanghai〕2012-0003。
L929细胞购自南京科佰生物科技有限公司,海藻糖粉剂购自上海迪派生物科技有限公司,卡波姆、三乙醇胺粉剂购自武汉拉那白医药化工有限公司,微管相关蛋白轻链3Ⅰ（microtubule-associated protein light chain 3 Ⅰ, LC3Ⅰ）和LC3Ⅱ的ELISA试剂盒购自艾博抗（上海）贸易有限公司,天狼星红、苦味酸购自上海麦克林生化科技股份有限公司。
DV2T型粘度计购自布鲁克菲尔德资产管理公司,TH-F120型透射电镜购自国仪量子技术（合肥）股份有限公司。
1.2 凝胶的配制
使用卡波姆作为凝胶基质,按照终质量分数2%海藻糖[10]、终质量分数0.5%卡波姆及适量三乙醇胺（调节凝胶pH值至7）配比制作海藻糖凝胶；同时配制不含海藻糖的卡波姆凝胶,作为后续实验的阳性对照。随后,采用15~25 kGy的辐照强度对凝胶进行灭菌。
1.2.1 凝胶的理化特性检测
按照《中华人民共和国药典》通则等检测2种凝胶的外观、粘度、成模率、阻菌率、重金属含量、保湿率、水蒸气透过率、无菌性。所有检测重复5次。
1.2.2 凝胶的生物相容性检测
按照GB/T 16886检测2种凝胶的细胞毒性、皮内刺激、致敏性。将凝胶溶解在生理盐水中,得到终质量浓度为0.2 g/mL凝胶浸提液,进行如下检测。（1）细胞毒性,按照1∶1的体积比将浸提液与常规细胞培养基混合,作为L929细胞的培养液。培养24 h后,于光学显微镜10倍放大倍数下观察细胞增殖情况及形态,同时采用噻唑蓝法检测细胞毒性。（2）皮内刺激,将1 mL浸提液注入5只新西兰白化模型兔预先剃净背部毛发的皮下,分别在24、48 h后观察皮肤红斑和肿块情况。（3）致敏性,将1 mL浸提液涂抹在5只豚鼠预先剃净背部毛发的皮肤上,分别在24、48、72 h观察皮肤红斑和肿块情况。所有检测重复5次。
1.3 创面愈合实验及观察指标
取30只SD大鼠,按照随机数字表法分为实验组、阳性对照组、阴性对照组,每组10只。在大鼠背部制作直径3 cm圆形全层皮肤缺损创面模型。对阴性对照组创面行含氯己定的消毒液、生理盐水冲洗以及碘伏浸润的油纱覆盖、无菌纱布包扎；对阳性对照组创面同前冲洗后涂抹卡波姆凝胶,其余操作同阴性对照组；对实验组创面涂抹海藻糖凝胶,其余操作与阴性对照组一致。每3天换药1次。在伤后0（即刻）、6、12 d拍照并计算创面愈合率。创面愈合率（%）=（创面初始面积-创面残余面积）÷创面初始面积×100%。伤后6 d,从每组中随机选择5只大鼠行颈椎脱臼处死。取前述大鼠创面组织,于透射电镜400倍放大倍数下观测其全部视野下组织中自噬体和自噬溶酶体数量,常规采用ELISA法检测组织中LC3Ⅰ和LC3Ⅱ含量并计算其比值,采用天狼星红-苦味酸染色法检测荧光显微镜400倍放大倍数下Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白占比及其比值和总胶原蛋白占比。统计每组剩余5只未处死大鼠创面的愈合时间。样本数均为5。
1.4 瘢痕预防实验
取3只新西兰白化模型兔,在每侧兔耳各制备3个直径1 cm的深达软骨膜的创面,分别设为实验组、阳性对照组、阴性对照组,每组6个创面。各组处理同SD大鼠创面模型。创面愈合后30 d,大体观察并使用温哥华瘢痕量表评估兔耳瘢痕情况。然后,行过量麻醉剂处死,取兔耳瘢痕组织并常规行HE染色,检测表皮和真皮的厚度；另取兔耳瘢痕组织行天狼星红-苦味酸染色,检测荧光显微镜400倍放大倍数下Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白占比及其比值和总胶原蛋白占比及其排布情况。样本数为6。
1.5 统计学处理
使用SPSS 26.0统计软件进行数据处理。计量资料数据均符合正态分布,以
2. 结果
2.1 凝胶的理化特性
辐照后的海藻糖凝胶和卡波姆凝胶均呈淡黄色透明状,无异味和杂质。海藻糖凝胶粘度、成膜率、阻菌性、保湿率均显著优于卡波姆凝胶（P<0.05）,但水蒸气透过率显著低于卡波姆凝胶（P<0.05）,见表1。2种凝胶均未检出重金属和细菌。
Table 1. 海藻糖凝胶和卡波姆凝胶理化特性比较（凝胶种类 样本数 粘度（Pa·s） 成膜率（%） 阻菌率（%） 保湿率（%） 水蒸气透过率（g/m2） 卡波姆凝胶 5 12.4±1.1 72.2±2.8 45.0±2.6 13.2±1.3 660±15 海藻糖凝胶 5 15.7±1.5 79.2±3.5 52.8±3.4 17.9±1.2 616±19 t值 4.13 3.50 4.03 5.80 -4.14 P值 0.003 0.008 0.004 0.003 <0.001 2.2 生物相容性
培养24 h后,卡波姆凝胶和海藻糖凝胶浸提液中的L929细胞生长状态均良好,细胞的存活率分别为（97.8±2.7）%和（99.7±3.7）%,差异无统计学意义（t=0.90,P=0.393）。皮内刺激24、48 h后,2种凝胶的红斑和水肿评分均为0,即皮内刺激阴性。刺激24、48、72 h后,2种凝胶对皮肤均无明显致敏表现,即致敏阴性。见图1。
图 1 海藻糖凝胶生物相容性检测。1A、1B.分别为24、48 h新西兰白化模型兔背部皮内刺激检测结果,均未观察到显著的红斑和水肿；1C.培养24 h后,L929细胞生长状态良好 光学显微镜×10；1D、1E、1F.分别为24、48、72 h豚鼠背部皮肤致敏性检测结果,均未观察到显著的红斑和水肿2.3 创面愈合情况
伤后6、12 d,阳性对照组大鼠创面愈合率明显高于阴性对照组（t值分别为-6.82和-4.58,P值分别为<0.001和0.002）,实验组大鼠创面愈合率明显高于阳性对照组（t值分别为-8.90和-4.25,P值分别为<0.001和0.003）和阴性对照组（t值分别为-8.78和-4.25,P值均<0.001）。阳性对照组和实验组大鼠创面愈合时间明显短于阴性对照组（t值分别为2.45、-4.49,P值分别为0.040、0.002）,见图2、表2。
图 2 3组大鼠伤后不同时间点全层皮肤缺损创面愈合情况。2A、2B、2C.分别为阴性对照组伤后0(即刻)、6、12 d创面情况；2D、2E、2F.分别为阳性对照组伤后0、6、12 d创面情况,图2E、2F中创面面积分别较图2B、2C缩小；2G、2H、2I.分别为实验组伤后0(即刻)、6、12 d创面情况,图2H、2I中创面面积分别较图2E、2F缩小注：阴性对照组采用常规换药,阳性对照组采用卡波姆凝胶换药,实验组采用海藻糖凝胶换药Table 2. 3组大鼠伤后不同时间点全层皮肤缺损创面愈合情况比较（组别 样本数 伤后6 d创面愈合率（%） 伤后12 d创面愈合率（%） 创面愈合时间（d） 阴性对照组 5 45.5±2.8 65.1±3.2 27.0±2.1 阳性对照组 5 52.9±2.0a 73.7±2.6a 23.4±2.5a 实验组 5 62.1±2.6ab 79.2±1.9ab 20.4±2.5a F值 112.15 39.03 9.58 P值 <0.001 <0.001 0.003 注：阴性对照组采用常规换药,阳性对照组采用卡波姆凝胶换药,实验组采用海藻糖凝胶换药；创面愈合率处理因素主效应,F=127.26,P<0.001；时间因素主效应,F=585.46,P<0.001；两者交互作用,F=1.24,P=0.301；与阴性对照组比较,aP<0.05；与阳性对照组比较,bP<0.05 伤后6 d,阳性对照组大鼠创面组织中自噬体和自噬溶酶体数量与阴性对照相近（t值分别为-1.77和-0.41,P值分别为0.115和0.694）；实验组大鼠创面组织中自噬体和自噬溶酶体数量均显著多于阳性对照组（t值分别为7.37和9.33,P值均<0.001）和阴性对照组（t值分别为-7.06和-8.54,P值均<0.001）。伤后6 d,阳性对照组大鼠创面组织中LC3Ⅱ含量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均显著高于阴性对照组（t值分别为-4.48和-2.47,P值分别为0.002和0.039）,LC3Ⅰ含量与阴性对照组相近（t=0.81,P=0.439）；实验组大鼠创面组织中LC3Ⅱ含量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均显著高于阴性对照组（t值分别为11.98和6.04,P值均<0.001）和阳性对照组（t值分别为-6.64和-4.17,P值分别为<0.001和0.003）,LC3Ⅰ含量明显低于阴性对照组（t=2.33,P=0.048）。见图3、表3。
图 3 3组大鼠伤后6 d全层皮肤缺损创面中自噬情况 透射电镜。3A与3B、3C与3D、3E与3F.分别为阴性对照组、阳性对照组、实验组,图3B、3D、3F（放大倍数为400）分别为图3A、3C、3E（放大倍数为4 000）红色线框中图形的放大图,可见图3F中有大量自噬体和自噬溶酶体（红色箭头所示）注：阴性对照组采用常规换药,阳性对照组采用卡波姆凝胶换药,实验组采用海藻糖凝胶换药Table 3. 3组大鼠伤后6 d全层皮肤缺损创面中自噬情况比较（组别 样本数 自噬体数量（个） 自噬溶酶体数量（个） LC3Ⅰ含量（ng/g） LC3Ⅱ含量（ng/g） LC3Ⅱ/LC3Ⅰ 阴性对照组 5 2.4±0.6 1.0±0.7 1.26±0.44 4.5±0.4 3.8±1.2 阳性对照组 5 6.6±1.1 1.2±0.8 1.07±0.31 6.1±0.7a 6.0±1.5a 实验组 5 10.0±2.4ab 7.9±1.9ab 0.79±0.14a 8.9±0.7ab 11.7±2.7ab F值 46.73 60.56 2.80 67.95 22.87 P值 <0.001 <0.001 0.100 <0.001 <0.001 注：阴性对照组采用常规换药,阳性对照组采用卡波姆凝胶换药,实验组采用海藻糖凝胶换药；LC3为微管相关蛋白轻链3；与阴性对照组比较,aP<0.05；与阳性对照组比较,bP<0.05 伤后6 d,3组大鼠创面组织中的总胶原蛋白和Ⅰ型胶原蛋白占比均相近,P>0.05。伤后6 d,阳性对照组大鼠创面组织中Ⅲ型胶原蛋白占比显著高于阴性对照组（t=-3.19,P=0.013）,且Ⅰ型胶原蛋白/Ⅲ型胶原蛋白显著低于阴性对照组（t=2.18,P=0.036）；实验组大鼠创面组织中Ⅲ型胶原蛋白占比显著高于阴性对照组和阳性对照组（t值分别为-2.38、5.91,P值分别为0.045、<0.001）,且Ⅰ型胶原蛋白/Ⅲ型胶原蛋白显著低于阴性对照组和阳性对照组（t值分别为3.08、-4.35,P值分别为0.015、0.002）。见图4、表4。
图 4 3组大鼠伤后6 d全层皮肤缺损创面组织中胶原情况 天狼星红-苦味酸×400。4A、4B、4C.分别为阴性对照组、阳性对照组、实验组大鼠创面情况,图4C中的Ⅲ型胶原蛋白面积（绿色荧光标示部分）占比较图4A与4B大注：阴性对照组采用常规换药,阳性对照组采用卡波姆凝胶换药,实验组采用海藻糖凝胶换药；Ⅰ型胶原蛋白阳性染色为黄色,Ⅲ型胶原蛋白阳性染色为绿色Table 4. 3组大鼠伤后6 d全层皮肤缺损创面组织中2种胶原蛋白占比及其比值的比较（组别 样本数 总胶原蛋白占比（%） Ⅰ型胶原蛋白占比（%） Ⅲ型胶原蛋白占比（%） Ⅰ型胶原蛋白/Ⅲ型胶原蛋白 阴性对照组 5 22±10 18±9 4.4±1.6 11.6±2.2 阳性对照组 5 31±9 23±8 8.3±2.2a 4.2±1.3a 实验组 5 32±6 23±7 11.6±2.2ab 2.8±0.7ab F值 1.78 0.61 15.86 10.71 P值 0.211 0.559 <0.001 0.002 注：阴性对照组采用常规换药,阳性对照组采用卡波姆凝胶换药,实验组采用海藻糖凝胶换药；与阴性对照组比较,aP<0.05；与阳性对照组比较,bP<0.05 2.4 瘢痕预防
创面愈合后30 d,可观察到阳性对照组兔耳瘢痕增生情况与阴性对照组相近,而实验组兔耳瘢痕增生情况明显减轻、颜色更接近周围正常皮肤,未明显凸出,见图5。创面愈合后30 d,阳性对照组兔耳瘢痕色泽、血管、厚度、硬度评分及总分与阴性对照组均相近（t值分别为0.42、0.62、0.62、<0.01、0.96,P值分别为0.687、0.549、0.549、>0.999、0.360）；实验组兔耳瘢痕色泽、血管、厚度、硬度评分及总分均明显低于阳性对照组（t值分别为3.80、3.80、2.39、2.71、4.84,P值分别为0.004、0.004、0.038、0.022、<0.001）和阴性对照组（t值分别为-3.81、-4.78、0.04、-2.71、-5.14,P值分别为0.003、<0.001、0.022、0.022、<0.001）,见图6。
图 5 3组新西兰白化模型兔耳创面愈合后30 d的瘢痕情况,最右侧瘢痕增生情况较左侧2个瘢痕明显减轻注：阴性对照组采用常规换药,阳性对照组采用卡波姆凝胶换药,实验组采用海藻糖凝胶换药；从左到右分别为阴性对照组、阳性对照组、实验组瘢痕
图 6 3组新西兰白化模型兔耳创面愈合后30 d的瘢痕评分比较（样本数6,
注：阴性对照组采用常规换药,阳性对照组采用卡波姆凝胶换药,实验组采用海藻糖凝胶换药；与阴性对照组相比,aP<0.05；与阳性对照组相比,bP<0.05创面愈合后30 d,实验组、阴性对照组和阳性对照组兔耳瘢痕组织中表皮厚度无明显差异（P>0.05）；阳性对照组兔耳瘢痕组织真皮厚度明显小于阴性对照组（t=5.42,P<0.001）,实验组兔耳瘢痕组织真皮厚度明显小于阴性对照组和阳性对照组（t值分别为11.91和8.49,P值均<0.001）。创面愈合后30 d,3组兔耳瘢痕组织中胶原蛋白排列均紊乱,总胶原蛋白占比相近（P>0.05）；实验组兔耳瘢痕组织中Ⅰ型胶原蛋白占比明显低于阳性对照组（t=3.00,P=0.013）,Ⅲ型胶原蛋白占比明显高于阴性对照组和阳性对照组（t值分别为-4.46和4.05,P值分别为0.001和0.002）,Ⅰ型胶原蛋白/Ⅲ型胶原蛋白明显低于阴性对照组和阳性对照组（t值分别为8.50和-5.25,P值均<0.001）。见图7、表5。
图 7 3组新西兰白化模型兔耳创面愈合后30 d瘢痕组织真皮厚度及胶原情况。7A、7B、7C.分别为阴性对照组、阳性对照组、实验组瘢痕组织真皮厚度情况,图7C中的真皮厚度明显小于图7A、7B 苏木精-伊红×400；7D、7E、7F.分别为阴性对照组、阳性对照组、实验组瘢痕组织胶原情况,图7F中的Ⅲ型胶原蛋白含量（绿色荧光标示部分）占比明显大于图7D、7E 天狼星红-苦味酸×400注：阴性对照组采用常规换药,阳性对照组采用卡波姆凝胶换药,实验组采用海藻糖凝胶换药Table 5. 3组新西兰白化模型兔耳创面愈合后30 d瘢痕组织的增生及胶原蛋白情况比较（组别 样本数 表皮厚度（μm） 真皮厚度（μm） 总胶原蛋白占比（%） Ⅰ型胶原蛋白占比（%） Ⅲ型胶原蛋白占比（%） Ⅰ型胶原蛋白/Ⅲ型胶原蛋白 阴性对照组 6 11.8±1.4 168±10 40±7 31.6±5.7 7.6±1.7 4.1±0.9 阳性对照组 6 11.7±1.8 141±7a 42±6 33.6±5.1 8.2±1.0 4.3±0.5 实验组 6 11.4±1.2 103±9ab 41±5 26.5±2.9b 14.7±3.5ab 1.9±0.4ab F值 0.12 86.31 0.17 3.65 15.84 24.14 P值 0.887 <0.001 0.842 0.051 <0.001 <0.001 注：阴性对照组采用常规换药,阳性对照组采用卡波姆凝胶换药,实验组采用海藻糖凝胶换药；与阴性对照组比较,aP<0.05；与阳性对照组比较,bP<0.05 3. 讨论
适度的自噬是细胞自我保护的重要机制,通过降解自身损伤的蛋白或细胞器,使之成为自我修复的原料,同时诱发一系列的病理生理活动[14,20]。已有研究证实,自噬也是促进创面愈合的重要作用机制之一[10, 11, 12]。创面的形成是一种应激刺激,虽然应激也是激活细胞自噬的因素之一,但是对于创面来说,应激激活的自噬不足以弥补应激本身对创面产生的不利影响。
海藻糖是众多生物的应激产物,是这些生物在面对恶劣生存环境时大量合成的产物,用以维持生存[21, 22, 23]。其中,海藻糖的自噬诱导活性在应激保护中起关键作用[10]。本研究基于海藻糖的自噬诱导活性,探索其在创面治疗中的应用效果。
为使海藻糖与创面充分、持续接触,本研究将海藻糖制成具有一定流动性的凝胶态,其良好的随形性使之可以与创面基底充分接触[24, 25, 26],且相较于海藻糖原材料的粉末状剂型,不易在创面形成药痂。所使用的凝胶基质为卡波姆,为避免凝胶本身所携带的病原微生物导致创面感染,在将其应用于创面前进行了辐照灭菌。本研究显示,海藻糖对于卡波姆的高分子结构在辐照条件下具有良好的保护作用,使辐照后的海藻糖凝胶的粘度高于卡波姆凝胶。基于粘度的差异,海藻糖凝胶具有更好的成模性、阻菌性和保湿性,这些特征都有利于创面愈合,成模性能提供良好物理屏障,阻菌性能减少外界环境中病原微生物对创面的侵袭,保湿性能提供湿性愈合环境[27, 28]。虽然相较于卡波姆凝胶,海藻糖凝胶的水蒸气透过率降低,但因所形成的物理屏障强度较低,因此无湿疹产生的风险[29]。另外,所制备的海藻糖凝胶具有良好的生物相容性,满足临床应用需求。
本研究显示,在动物创面模型的应用中,虽然不含海藻糖的卡波姆凝胶也能一定程度促进创面愈合,但海藻糖凝胶的促进愈合活性更佳。卡波姆凝胶的促愈合作用主要基于其理化特性,如成模性、阻菌性和保湿性[27, 28, 29, 30, 31]。海藻糖凝胶除了具有良好的理化特性,还具有生物活性[10]。本研究通过透射电镜观察到,相较于阴性对照组,实验组大鼠全层皮肤缺损创面组织内自噬活性增强,且无论是自噬体还是自噬溶酶体的数量均显著增多,这提示海藻糖不但激活了自噬,而且能保障自噬的顺利进展,为创面细胞的自我修复提供了良好的保障。同时,LC3Ⅰ含量下降、LC3Ⅱ含量以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ增高,均提示自噬增强。另外,海藻糖凝胶还促进了创面愈合组织中Ⅲ型胶原蛋白的合成,并降低了Ⅰ型胶原蛋白/Ⅲ型胶原蛋白的比例。Ⅲ型胶原蛋白是皮肤软组织中的重要组分之一,在创面愈合过程中Ⅲ型胶原蛋白合成减少,从而导致Ⅰ型胶原蛋白/Ⅲ型胶原蛋白增加,是病理性瘢痕增生的重要因素；此外,Ⅲ型胶原蛋白占比高是母体内胎儿不会形成瘢痕增生的重要因素之一[31, 32, 33]。这一现象提示海藻糖具有潜在瘢痕预防活性。
本研究中的兔耳瘢痕模型验证了这一假设。单纯的卡波姆凝胶无法改善瘢痕增生,温哥华瘢痕量表评分未显著降低。但海藻糖凝胶显著减轻了瘢痕增生,无论是色泽、血管还是厚度、硬度,总分均显著降低。组织学观察也证实了海藻糖对瘢痕的改善作用。
本研究基于海藻糖制备了具有良好理化特性和生物相容性的随形性凝胶,验证了其通过自噬促进创面愈合、改善瘢痕增生的活性。但仍需开展更深入的作用机制探索,为其临床应用提供理论依据。
金剑：酝酿和设计实验、实施研究、采集数据、整理数据、统计分析、撰写论文、修改论文；储云高：研究指导、数据整理、论文修改、经费支持所有作者均声明不存在利益冲突 -
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图 1 海藻糖凝胶生物相容性检测。1A、1B.分别为24、48 h新西兰白化模型兔背部皮内刺激检测结果,均未观察到显著的红斑和水肿；1C.培养24 h后,L929细胞生长状态良好 光学显微镜×10；1D、1E、1F.分别为24、48、72 h豚鼠背部皮肤致敏性检测结果,均未观察到显著的红斑和水肿
图 2 3组大鼠伤后不同时间点全层皮肤缺损创面愈合情况。2A、2B、2C.分别为阴性对照组伤后0(即刻)、6、12 d创面情况；2D、2E、2F.分别为阳性对照组伤后0、6、12 d创面情况,图2E、2F中创面面积分别较图2B、2C缩小；2G、2H、2I.分别为实验组伤后0(即刻)、6、12 d创面情况,图2H、2I中创面面积分别较图2E、2F缩小
注：阴性对照组采用常规换药,阳性对照组采用卡波姆凝胶换药,实验组采用海藻糖凝胶换药
图 3 3组大鼠伤后6 d全层皮肤缺损创面中自噬情况 透射电镜。3A与3B、3C与3D、3E与3F.分别为阴性对照组、阳性对照组、实验组,图3B、3D、3F（放大倍数为400）分别为图3A、3C、3E（放大倍数为4 000）红色线框中图形的放大图,可见图3F中有大量自噬体和自噬溶酶体（红色箭头所示）
注：阴性对照组采用常规换药,阳性对照组采用卡波姆凝胶换药,实验组采用海藻糖凝胶换药
图 4 3组大鼠伤后6 d全层皮肤缺损创面组织中胶原情况 天狼星红-苦味酸×400。4A、4B、4C.分别为阴性对照组、阳性对照组、实验组大鼠创面情况,图4C中的Ⅲ型胶原蛋白面积（绿色荧光标示部分）占比较图4A与4B大
注：阴性对照组采用常规换药,阳性对照组采用卡波姆凝胶换药,实验组采用海藻糖凝胶换药；Ⅰ型胶原蛋白阳性染色为黄色,Ⅲ型胶原蛋白阳性染色为绿色
图 5 3组新西兰白化模型兔耳创面愈合后30 d的瘢痕情况,最右侧瘢痕增生情况较左侧2个瘢痕明显减轻
注：阴性对照组采用常规换药,阳性对照组采用卡波姆凝胶换药,实验组采用海藻糖凝胶换药；从左到右分别为阴性对照组、阳性对照组、实验组瘢痕
图 6 3组新西兰白化模型兔耳创面愈合后30 d的瘢痕评分比较（样本数6,
注：阴性对照组采用常规换药,阳性对照组采用卡波姆凝胶换药,实验组采用海藻糖凝胶换药；与阴性对照组相比,aP<0.05；与阳性对照组相比,bP<0.05
图 7 3组新西兰白化模型兔耳创面愈合后30 d瘢痕组织真皮厚度及胶原情况。7A、7B、7C.分别为阴性对照组、阳性对照组、实验组瘢痕组织真皮厚度情况,图7C中的真皮厚度明显小于图7A、7B 苏木精-伊红×400；7D、7E、7F.分别为阴性对照组、阳性对照组、实验组瘢痕组织胶原情况,图7F中的Ⅲ型胶原蛋白含量（绿色荧光标示部分）占比明显大于图7D、7E 天狼星红-苦味酸×400
注：阴性对照组采用常规换药,阳性对照组采用卡波姆凝胶换药,实验组采用海藻糖凝胶换药
Table 1. 海藻糖凝胶和卡波姆凝胶理化特性比较（
凝胶种类 样本数 粘度（Pa·s） 成膜率（%） 阻菌率（%） 保湿率（%） 水蒸气透过率（g/m2） 卡波姆凝胶 5 12.4±1.1 72.2±2.8 45.0±2.6 13.2±1.3 660±15 海藻糖凝胶 5 15.7±1.5 79.2±3.5 52.8±3.4 17.9±1.2 616±19 t值 4.13 3.50 4.03 5.80 -4.14 P值 0.003 0.008 0.004 0.003 <0.001 
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Table 2. 3组大鼠伤后不同时间点全层皮肤缺损创面愈合情况比较（
组别 样本数 伤后6 d创面愈合率（%） 伤后12 d创面愈合率（%） 创面愈合时间（d） 阴性对照组 5 45.5±2.8 65.1±3.2 27.0±2.1 阳性对照组 5 52.9±2.0a 73.7±2.6a 23.4±2.5a 实验组 5 62.1±2.6ab 79.2±1.9ab 20.4±2.5a F值 112.15 39.03 9.58 P值 <0.001 <0.001 0.003 注：阴性对照组采用常规换药,阳性对照组采用卡波姆凝胶换药,实验组采用海藻糖凝胶换药；创面愈合率处理因素主效应,F=127.26,P<0.001；时间因素主效应,F=585.46,P<0.001；两者交互作用,F=1.24,P=0.301；与阴性对照组比较,aP<0.05；与阳性对照组比较,bP<0.05
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Table 3. 3组大鼠伤后6 d全层皮肤缺损创面中自噬情况比较（
组别 样本数 自噬体数量（个） 自噬溶酶体数量（个） LC3Ⅰ含量（ng/g） LC3Ⅱ含量（ng/g） LC3Ⅱ/LC3Ⅰ 阴性对照组 5 2.4±0.6 1.0±0.7 1.26±0.44 4.5±0.4 3.8±1.2 阳性对照组 5 6.6±1.1 1.2±0.8 1.07±0.31 6.1±0.7a 6.0±1.5a 实验组 5 10.0±2.4ab 7.9±1.9ab 0.79±0.14a 8.9±0.7ab 11.7±2.7ab F值 46.73 60.56 2.80 67.95 22.87 P值 <0.001 <0.001 0.100 <0.001 <0.001 注：阴性对照组采用常规换药,阳性对照组采用卡波姆凝胶换药,实验组采用海藻糖凝胶换药；LC3为微管相关蛋白轻链3；与阴性对照组比较,aP<0.05；与阳性对照组比较,bP<0.05
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Table 4. 3组大鼠伤后6 d全层皮肤缺损创面组织中2种胶原蛋白占比及其比值的比较（
组别 样本数 总胶原蛋白占比（%） Ⅰ型胶原蛋白占比（%） Ⅲ型胶原蛋白占比（%） Ⅰ型胶原蛋白/Ⅲ型胶原蛋白 阴性对照组 5 22±10 18±9 4.4±1.6 11.6±2.2 阳性对照组 5 31±9 23±8 8.3±2.2a 4.2±1.3a 实验组 5 32±6 23±7 11.6±2.2ab 2.8±0.7ab F值 1.78 0.61 15.86 10.71 P值 0.211 0.559 <0.001 0.002 注：阴性对照组采用常规换药,阳性对照组采用卡波姆凝胶换药,实验组采用海藻糖凝胶换药；与阴性对照组比较,aP<0.05；与阳性对照组比较,bP<0.05
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Table 5. 3组新西兰白化模型兔耳创面愈合后30 d瘢痕组织的增生及胶原蛋白情况比较（
组别 样本数 表皮厚度（μm） 真皮厚度（μm） 总胶原蛋白占比（%） Ⅰ型胶原蛋白占比（%） Ⅲ型胶原蛋白占比（%） Ⅰ型胶原蛋白/Ⅲ型胶原蛋白 阴性对照组 6 11.8±1.4 168±10 40±7 31.6±5.7 7.6±1.7 4.1±0.9 阳性对照组 6 11.7±1.8 141±7a 42±6 33.6±5.1 8.2±1.0 4.3±0.5 实验组 6 11.4±1.2 103±9ab 41±5 26.5±2.9b 14.7±3.5ab 1.9±0.4ab F值 0.12 86.31 0.17 3.65 15.84 24.14 P值 0.887 <0.001 0.842 0.051 <0.001 <0.001 注：阴性对照组采用常规换药,阳性对照组采用卡波姆凝胶换药,实验组采用海藻糖凝胶换药；与阴性对照组比较,aP<0.05；与阳性对照组比较,bP<0.05
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