中华烧伤与创面修复杂志

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严重烧伤早期心肌损害机制及临床意义的再认识

黄跃生

2016, 32(5): 257-259. doi: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2016.05.001

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252例严重烧伤患者心肌损伤情况的回顾性研究

张灿, 张均辉, 张东霞, 谢卫国, 蒋章佳, 林国安, 牛希华, 黄跃生

2016, 32(5): 260-265. doi: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2016.05.002

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摘要:
目的回顾性分析严重烧伤患者发生心肌损伤的危险因素及临床表现，为其防治提供依据。方法 2010年1月—2015年6月，5家笔者单位收治符合入选标准的252例严重烧伤患者，按第三军医大学补液公式进行液体复苏。根据入院时治疗前心肌型肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平，将患者分为非心肌损伤组(CK-MB<75 U/mL)118例和心肌损伤组(CK-MB≥75 U/mL)134例。统计2组患者性别、年龄、体质量、化学烧伤例数、伤后入院时间、烧伤总面积、Ⅲ度面积、吸入性损伤例数，入院时及伤后24、48 h Hb、血细胞比容、血乳酸，伤后24、48 h尿量、补液量，入院时及伤后24、48 h肌酐、尿素氮、总胆汁酸、二胺氧化酶水平，病死率。另外将患者按照烧伤总面积分为3组：小于50%TBSA组110例、大于或等于50%TBSA且小于80%TBSA组83例、大于或等于80%TBSA组59例，统计3组患者心肌损伤发生率。对数据行χ²检验、t检验、Wilcoxon检验、重复测量方差分析，并进行Bonferroni校正。对252例患者基本资料行二分类logistic回归分析，筛选心肌损伤的独立危险因素；绘制252例患者烧伤总面积的受试者工作特征曲线，评估其对心肌损伤发生的预测效果。结果 (1)2组患者年龄、体质量、化学烧伤例数、吸入性损伤例数、Ⅲ度面积比较，差异不明显(t值分别为0.20、0.31，χ²值分别为0.49、4.10，Z＝1.42，P值均大于0.05)；性别、伤后入院时间、烧伤总面积比较，差异明显(χ²＝5.00，t值分别为2.44、3.13，P<0.05或P<0.01)。(2)性别、伤后入院时间、烧伤总面积是影响患者心肌损伤的独立危险因素(比值比分别为2.608、3.620、1.030，95%置信区间分别为1.315～5.175、1.916～6.839、1.011～1.049，P值均小于0.01)。(3)小于50%TBSA组、大于或等于50%TBSA且小于80%TBSA组、大于或等于80%TBSA组患者心肌损伤发生率分别为38.2%(42/110)、54.2%(45/83)、61.0%(36/59)，总体比较差异明显(χ²＝9.46，P<0.05)。(4)对252例患者心肌损伤发生预测的烧伤总面积的受试者工作特征曲线下总面积为0.706(95%置信区间为0.641～0.772，P<0.01)，烧伤总面积的最佳阈值为51.5%TBSA，其对心肌损伤发生预测的敏感度为62.6%、特异度为65.3%。(5)与非心肌损伤组比较，除伤后48 h Hb和血细胞比容无明显变化(t值分别为－0.76、－0.61，P值均大于0.05)外，心肌损伤组患者Hb、血细胞比容、血乳酸水平各时相点明显升高(t值为－2.80～－2.06，P<0.05或P<0.01)。与非心肌损伤组比较，心肌损伤组患者尿量伤后24、48 h减少(t值分别为2.05、3.68，P<0.05或P<0.01)，补液量伤后24、48 h无明显变化(t值分别为1.01、1.08，P值均大于0.05)。(6)与非心肌损伤组比较，心肌损伤组患者肌酐水平入院时及伤后24、48 h明显升高(Z值为－2.91～－1.99，P<0.05或P<0.01)，尿素氮水平仅伤后24、48 h明显升高(t值分别为－4.75、－5.24，P值均小于0.01)，总胆汁酸水平入院时及伤后24、48 h无明显变化(t值为－0.81～－0.20，P值均大于0.05)，二胺氧化酶水平仅入院时、伤后24 h明显升高(t值分别为－3.97、－2.02，P<0.05或P<0.01)。(7)非心肌损伤组患者病死率明显低于心肌损伤组(χ²＝5.81，P<0.05)。结论严重烧伤患者心肌损伤发生率高，烧伤总面积可预测严重烧伤患者心肌损伤的发生。严重烧伤伴心肌损伤的患者，休克期更容易出现有效循环容量减少、组织氧合障碍及其他脏器损伤。

乌司他丁对严重烧伤大鼠脾脏免疫功能的影响及机制

李俊聪, 胡超, 姚咏明, 杨红明

2016, 32(5): 266-271. doi: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2016.05.003

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目的观察乌司他丁对严重烧伤大鼠脾脏CD4^＋T淋巴细胞和CD4^＋CD25^＋调节性T淋巴细胞(Treg)免疫功能及外周血高迁移率族蛋白B1(HMGB1)含量的影响，并分析其可能机制。方法将96只雄性SD大鼠按照随机数字表法分为假伤组、单纯烧伤组和乌司他丁组，每组32只。假伤组大鼠背部浸入37 ℃温水中12 s模拟致伤；单纯烧伤组、乌司他丁组大鼠背部浸入94 ℃热水中12 s，造成30%TBSAⅢ度烫伤(以下称烧伤)。各组大鼠伤后即刻起腹腔注射生理盐水40 mL/kg，乌司他丁组大鼠同时腹腔注射乌司他丁4×10⁴ U/kg，每隔12小时注射1次，持续至伤后72 h。于伤后1、3、5、7 d，每组各取8只大鼠采集腹主动脉血，采用ELISA法检测血清HMGB1含量，随即处死大鼠取脾脏组织，分选CD4^＋CD25^＋Treg和CD4^＋T淋巴细胞。采用流式细胞仪检测CD4^＋CD25^＋Treg中细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)、叉头翼状螺旋转录因子p3(Foxp3)阳性表达率，采用ELISA法检测CD4^＋CD25^＋Treg培养上清液中IL-10含量；采用ELISA法检测CD4^＋T淋巴细胞培养上清液中IL-2、IL-4和γ干扰素含量，采用酶标仪测定CD4^＋T淋巴细胞增殖活性，各组各时相点样本数为8。对数据行析因设计方差分析和LSD检验。结果 (1)与假伤组比较，单纯烧伤组大鼠伤后1～7 d血清HMGB1含量明显增加(P值均小于0.01)。与单纯烧伤组比较，乌司他丁组大鼠伤后1～7 d血清HMGB1含量明显减少(P值均小于0.01)。(2)与假伤组比较，单纯烧伤组大鼠伤后1～7 d CD4^＋CD25^＋Treg中CTLA-4、Foxp3阳性表达率及细胞培养上清液中IL-10含量明显升高或增加(P值均小于0.01)，于伤后3 d达最大值，分别为(65±10)%、(76±10)%、(28.2±4.4)pg/mL，此时假伤组大鼠该3项指标分别为(45±7)%、(46±7)%、(11.2±2.3)pg/mL。与单纯烧伤组比较，乌司他丁组大鼠伤后1～7 d CD4^＋CD25^＋Treg中CTLA-4、Foxp3阳性表达率及细胞培养上清液中IL-10含量明显降低或减少(P<0.05或P<0.01)，分别于伤后7、1、7 d达最低值[(43±6)%、(50±8)%、(12.4±3.4)pg/mL]，此时单纯烧伤组大鼠该3项指标分别为(58±8)%、(71±9)%、(19.7±2.8)pg/mL。(3)与假伤组比较，单纯烧伤组大鼠伤后1～7 d CD4^＋T淋巴细胞培养上清液中IL-2和γ干扰素含量明显减少、IL-4含量明显增加(P值均小于0.01)。与单纯烧伤组比较，乌司他丁组大鼠伤后1～7 d CD4^＋T淋巴细胞培养上清液中IL-2和γ干扰素含量明显增加、IL-4含量明显减少(P<0.05或P<0.01)。(4)与假伤组比较，单纯烧伤组大鼠伤后1～7 d CD4^＋T淋巴细胞增殖活性明显减弱(P值均小于0.01)。与单纯烧伤组比较，乌司他丁组大鼠伤后1～7 d CD4^＋T淋巴细胞增殖活性明显增强(P值均小于0.01)。结论乌司他丁可减弱严重烧伤大鼠脾脏CD4^＋CD25^＋Treg介导的免疫抑制功能，改善脾脏CD4^＋T淋巴细胞的分泌和增殖功能，原因可能为其抑制了体内HMGB1的大量释放。

细胞外热休克蛋白70对严重烫伤大鼠肠道免疫功能的影响

邓鸿敖, 张红艳, 熊林朋, 彭燕

2016, 32(5): 272-276. doi: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2016.05.004

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目的了解严重烫伤大鼠肠道细胞外热休克蛋白70(eHSP70)与IL-2表达变化及两者间的关系，另体外观察eHSP70对严重烫伤大鼠肠道派伊尔结CD3^＋T淋巴细胞的影响。方法 (1)取60只雄性SD大鼠，按随机数字表法分为正常对照组(仅麻醉)10只、烫伤组50只，烫伤组大鼠背部造成30%TBSAⅢ度烫伤。正常对照组于麻醉后即刻，烫伤组于伤后3、6、12、24、48 h，各取10只大鼠处死，取小肠组织，ELISA法检测eHSP70和IL-2的表达并进行相关分析。(2)另取2只雄性SD大鼠，同前致伤后12 h，分离小肠派伊尔结CD3^＋T淋巴细胞，用含体积分数10%FBS的RPMI 1640培养液培养，按随机数字表法分为空白对照组和5、10、20 μg/mL eHSP70组，每组6孔。空白对照组不行其他处理，后3组培养液中分别加入相应质量浓度重组大鼠eHSP70。培养48 h，流式细胞仪检测CD3^＋T淋巴细胞中Th1和Th2百分比及细胞凋亡率，ELISA法检测细胞培养上清液中IL-2和IL-10的表达。细胞实验均重复10次。对数据行单因素方差分析、Kruskal-Wallis秩和检验、SNK-q检验、Pearson相关分析。结果 (1)与正常对照组的(1 278±135)、(48.6±4.9)ng/mg比较，烫伤组大鼠伤后3、6、12、24、48 h肠道eHSP70[(728±93)、(412±31)、(314±21)、(528±40)、(1 028±97)ng/mg]和IL-2[(38.6±2.3)、(32.3±1.0)、(25.3±3.6)、(33.9±4.1)、(44.3±2.6)ng/mg]水平均明显降低(q值为3.48～5.32，P值均小于0.05)，均于伤后12 h达最低值。IL-2和eHSP70水平呈明显正相关(r＝0.920，P<0.01)。(2)与空白对照组的(8.6±1.1)%、(3.75±0.45)%比较，5、10、20 μg/mL eHSP70组CD3^＋T淋巴细胞中Th1百分比明显增高[(11.3±2.1)%、(15.7±1.8)%、(10.8±1.5)%，q值为2.97～4.57，P值均小于0.05]，Th2百分比明显降低[(2.39±0.38)%、(1.05±0.23)%、(2.67±0.26)%，q值为2.48～4.32，P值均小于0.05]。与空白对照组的(34.3±2.2)%、(254±16)pg/mL比较，5、10、20 μg/mL eHSP70组CD3^＋T淋巴细胞凋亡率明显降低[(26.1±2.6)%、(20.7±1.5)%、(31.5±2.4)%，q值为3.47～4.95，P值均小于0.05]，细胞培养上清液中IL-2水平明显增高[(417±22)、(587±19)、(307±27)pg/mL，q值为3.02～4.98，P值均小于0.05]。4组CD3^＋T淋巴细胞培养上清液中IL-10水平相近(F＝2.12，P>0.05)。结论大鼠严重烫伤后肠道中eHSP70和IL-2的表达均降低，且两者呈明显正相关。eHSP70可体外促进严重烫伤大鼠肠道派伊尔结中CD3^＋T淋巴细胞向Th1方向分化，明显降低其凋亡率，促进其释放IL-2。

非诺贝特对严重烧伤大鼠肝脏脂肪变性的疗效观察

黄宗伟, 蒙诚跃, 陈婧, 陈雅洁, 陈渝, 周涛, 阳超

2016, 32(5): 277-282. doi: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2016.05.005

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目的观察非诺贝特对严重烧伤大鼠肝脏脂肪变性的疗效。方法将27只雄性SD大鼠按照随机数字表法分为假伤组、单纯烧伤组、烧伤＋非诺贝特组，每组9只。假伤组大鼠将背部浸入37 ℃温水中15 s模拟致伤，之后不予处理。其余2组大鼠将背部浸入98 ℃热水中15 s造成30%TBSAⅢ度烫伤(以下称烧伤)，伤后1 h腹腔注射乳酸钠林格液。伤后24 h起，烧伤＋非诺贝特组大鼠给予生理盐水稀释的非诺贝特(药物剂量为80 mg·kg^－1·d^－1)，连续给药7 d，单纯烧伤组大鼠则给予等体积生理盐水。(1)于伤后4、6、8 d，各组分别选取3只大鼠采集下腔静脉血，采用全自动生化分析仪检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、游离脂肪酸(FFA)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)含量；取血后称取大鼠体质量，随即处死大鼠取肝脏称取湿质量，计算后者与前者比值即肝脏指数，同时行肝脏组织大体观察。(2)各时相点下每只大鼠留取1块肝脏组织样本，HE染色观察组织病理学变化；各时相点下每只大鼠选取1张HE染色切片，评估肝脏脂肪变性程度，并统计各组各级肝脏脂肪变性鼠数。对计量资料行析因设计方差分析及SNK检验，对计数资料行Kruskal-Wallis检验和Nemenyi检验。结果 (1)伤后4 d，单纯烧伤组大鼠TC、TG、FFA、HDL含量与假伤组比较，差异明显(P值均小于0.05)；烧伤＋非诺贝特组大鼠TC、TG、FFA含量均明显低于单纯烧伤组(P值均小于0.05)，HDL含量与单纯烧伤组相近(P>0.05)；3组大鼠LDL含量相近(P值均大于0.05)。伤后6 d，单纯烧伤组大鼠TC、TG、HDL含量与假伤组比较，差异明显(P值均小于0.05)；烧伤＋非诺贝特组大鼠TC、TG含量均明显低于单纯烧伤组(P值均小于0.05)，HDL含量明显高于单纯烧伤组(P<0.05)；3组大鼠FFA、LDL含量相近(P值均大于0.05)。伤后8 d，单纯烧伤组大鼠TC、HDL含量与假伤组比较，差异明显(P值均小于0.05)；烧伤＋非诺贝特组大鼠TC含量明显低于单纯烧伤组(P<0.05)，HDL含量与单纯烧伤组相近(P>0.05)。3组大鼠TG、FFA和LDL含量相近(P值均大于0.05)。(2)假伤组大鼠伤后各时相点肝脏组织大体情况与烧伤＋非诺贝特组相似，质地柔嫩，切面无油脂沾染。单纯烧伤组大鼠伤后各时相点肝脏组织表面散在暗黄色斑块，切面有油脂沾染，以伤后6 d最为明显。伤后4 d，假伤组、单纯烧伤组、烧伤＋非诺贝特组大鼠肝脏指数相近(F＝1.63，P>0.05)。伤后6、8 d，假伤组、单纯烧伤组、烧伤＋非诺贝特组大鼠肝脏指数分别为0.041 6±0.001 6、0.053 3±0.005 4、0.037 0±0.006 9及0.042 3±0.003 4、0.062 4±0.000 5、0.044 4±0.004 2，其中单纯烧伤组大鼠肝脏指数明显高于其余2组(P值均小于0.05)，假伤组、烧伤＋非诺贝特组大鼠肝脏指数相近(P值均大于0.05)。(3)假伤组大鼠伤后各时相点肝脏组织结构正常；单纯烧伤组大鼠伤后各时相点存在弥散小泡性肝细胞脂肪变性，以伤后6 d最为明显；烧伤＋非诺贝特组大鼠伤后4 d肝脏有轻度脂肪变性，伤后6 d起肝脏组织结构逐渐恢复正常。假伤组大鼠肝脏脂肪变性程度均为0级；单纯烧伤组大鼠肝脏脂肪变性程度为Ⅰ级1只、Ⅱ级1只、Ⅲ级7只；烧伤＋非诺贝特组大鼠肝脏脂肪变性程度为0级3只、Ⅰ级4只、Ⅱ级2只。单纯烧伤组大鼠肝脏脂肪变性程度重于其余2组(χ²值分别为56.25、162.44，P值均小于0.05)，烧伤＋非诺贝特组大鼠肝脏脂肪变性程度重于假伤组(χ²＝27.51，P<0.05)。结论非诺贝特能纠正严重烧伤大鼠血脂代谢异常，在一定程度上减轻肝脏脂肪变性程度。

烟雾吸入性损伤兔模型的建立

马彦波, 沈岳, 赖西南, 李新岭, 王建民, 王丽丽

2016, 32(5): 283-286. doi: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2016.05.006

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目的建立烟雾吸入量稳定可控的吸入性损伤兔模型。方法设计制作由管道连通集成的烟雾生成和吸入致伤一体化装置，主要组成部分为供气单元、烟雾生成单元、水浴冷却箱、烟雾储存罐、动物呼吸机、废气净化池。选取30只健康成年新西兰大白兔，按照随机数字表法分为对照组6只、烟雾吸入3 min组8只、烟雾吸入6 min组8只、烟雾吸入10 min组8只，对照组兔吸入空气10 min，后3组兔采用前述装置吸入相应时间的烟雾致伤。采用复合气体检测仪和气相色谱质谱联用仪分析烟雾温度及成分；监测3个致伤组兔伤后12 h内呼吸频率、心率及平均动脉压的变化，对照组兔亦进行相同监测。伤后即刻采集3个致伤组兔右股动脉血检测碳氧血红蛋白含量，另外于伤后即刻、30 min及1、3、6、12 h采集烟雾吸入10 min组兔右股动脉血检测pH值、PaCO₂、缓冲碱、碳酸氢根离子、PaO₂及SaO₂，对照组随烟雾吸入10 min组在伤后即刻进行前述检测。伤后12 h，取3个致伤组兔右肺上叶组织观察大体及病理改变，对照组兔亦于同时相点进行观察。对数据行单因素方差分析和t检验。结果 (1)烟雾温度为(31.2±0.8)℃，氧气体积分数为(14.8±1.9)%，一氧化碳体积分数为(0.063±0.003)%，二氧化硫体积分数为(0.007 8±0.000 6)%。烟雾中含有机气体近百余种，挥发性有机物总含量达(429±7)mg/m³，以烷、苯、腈类含量较高。(2)3个致伤组兔伤后出现呼吸急促、心率降低、平均动脉压降低现象，对照组兔呼吸频率、心率及平均动脉压均正常。(3)烟雾吸入3 min组、烟雾吸入6 min组、烟雾吸入10 min组兔伤后即刻碳氧血红蛋白含量分别为(25.5±2.9)%、(46.0±4.1)%、(70.3±5.4)%，均显著高于对照组的(8.3±0.9)%，t值分别为13.54、26.39、34.60，P值均小于0.01。(4)与对照组比较，烟雾吸入10 min组兔伤后各时相点pH值、PaO₂、SaO₂明显降低，PaCO₂于伤后30 min～12 h明显升高，缓冲碱于伤后30 min及1 h明显降低、伤后12 h明显升高，碳酸氢根离子于伤后即刻至伤后3 h明显降低、伤后6 h及12 h明显升高(t值为4.68～9.73，P<0.05或P<0.01)。(5)对照组兔双肺红润，肺泡间隔清晰、结构整齐；伤后12 h，3个致伤组兔肺组织出现水肿、充血、炎性细胞浸润、肺泡间隔变化等现象，以烟雾吸入10 min组病变最为严重。结论笔者采用自行设计制作的烟雾吸入性损伤装置，成功建立烟雾吸入量准确可控、损伤程度一致性好的吸入性损伤兔模型。

相对低热持续作用致大面积烧伤后多器官功能障碍综合征一例

曹胜军, 王凌峰, 巴特

2016, 32(5): 287-288. doi: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2016.05.007

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早期目标导向治疗应用于严重脓毒症和脓毒性休克的研究进展

孙薇, 袁宏勋, 安友仲

2016, 32(5): 289-292. doi: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2016.05.008

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室内火灾导致的烟雾吸入性损伤患者救治体会

唐棣(译者), 黄跃生(审校者)

2016, 32(5): 286-286. doi: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2016.05.101

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缺氧预定命运图可识别成体心脏循环心肌细胞

江旭品(译者), 黄跃生(审校者)

2016, 32(5): 288-288. doi: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2016.05.102

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间断饥饿处理可反复激活自噬-溶酶体途径防止心肌缺血-再灌注损伤

张均辉(译者), 黄跃生(审校者)

2016, 32(5): 288-288. doi: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2016.05.103

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187例瘢痕癌患者临床特点分析

刘赞, 周宇翔, 张丕红, 张明华, 任利成, 曾纪章, 周捷, 梁鹏飞, 黄晓元

2016, 32(5): 293-298. doi: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2016.05.009

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目的分析瘢痕癌的病因学及临床特征，并探讨其防治方法。方法回顾性分析1998年1月—2015年5月中南大学湘雅医院烧伤重建外科收治的187例瘢痕癌患者的病历资料。统计患者性别、初始伤或原发病发生年龄、瘢痕癌发生年龄，初始伤或原发病、潜伏期长短、溃疡前期长短、溃疡后期长短、病变部位、病灶类型、病灶面积、局部瘢痕张力情况，组织病理学类型、细胞分化程度，骨侵犯及淋巴结病变情况，治疗方法及预后。对初始伤或原发病发生年龄与潜伏期长短、溃疡前期长短与溃疡后期长短进行Spearman相关分析，对复发情况行Fisher确切概率法检验。结果 (1)本组患者男女比例约1.6∶1.0，初始伤或原发病发生年龄为0.17～78.00(17±18)岁，瘢痕癌发生年龄为18～84(49±14)岁。(2)本组患者初始伤最常见的为火焰烧伤。潜伏期0.25～74.00(32±16)年，溃疡前期0～73.00(26±19)年、溃疡后期0.08～59.00(6±11)年。病变部位常见于下肢及头面部，病灶类型以侵蚀性溃疡最为常见，病灶面积为1～625(69±110)cm²。初始伤或原发病发生年龄与潜伏期长短、溃疡前期长短与溃疡后期长短均呈明显负相关(r值分别为－0.71、－0.50，P值均小于0.01)。176例患者病变周围存在张力较大的病理性瘢痕。(3)组织病理学类型以鳞状细胞癌为主，细胞高分化者居多。(4)本组患者有59例出现癌细胞骨侵犯，100例出现淋巴结肿大，18例出现癌细胞淋巴结转移。(5)本组患者中20例未行手术；167例采用手术治疗，以病灶扩大切除术为主。根据病灶扩大切除术后的创面情况，主要行皮片移植修复和局部皮瓣转移修复。139例行病灶扩大切除术患者创面绝大部分为一次性修复。104例随访患者中28例术后复发，头面部、上肢、下肢、臀部复发情况差异不明显(P>0.05)，复发时间以愈后6个月以上为主。结论瘢痕癌患者初始伤或原发病发生年龄越小，经历的潜伏期越长；潜伏期内溃疡前期越短，溃疡后期则越长。瘢痕癌可能多发生于张力较大的瘢痕部位，提示尽早治疗高张力瘢痕与瘢痕溃疡是重要预防措施。手术扩大切除是治疗瘢痕癌的首选方法，术后有一定的复发率，应定期随访。

雌激素在小鼠表皮发育与人表皮细胞株HaCaT增殖中的作用与机制

周涛, 陈婧, 黄宗伟, 方利, 陈渝, 陈雅洁, 彭毅志

2016, 32(5): 299-304. doi: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2016.05.010

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目的观察雌激素在小鼠表皮发育和KC(人表皮细胞株HaCaT)增殖中的作用并探讨其机制。方法 (1)通过阴道脱落细胞检查法选取5只处于动情期成年C57BL/6小鼠设为动情期组，另将性发育前行卵巢切除的5只成年C57BL/6小鼠设为卵巢切除组。取2组小鼠尾根部全层皮肤，HE染色观测表皮厚度，免疫组织化学染色观察表皮中增殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞分布并计数。(2)取对数生长期HaCaT细胞，用含体积分数10%FBS的RPMI 1640培养液培养，按随机数字表法分为阴性对照组、单纯雌二醇组、蛋白激酶B(Akt)抑制剂组、细胞外信号调节激酶(ERK)抑制剂组，每组20孔。各组培养液中，阴性对照组加入1 μL二甲基亚砜；单纯雌二醇组加入100 nmol/L 17β-雌二醇1 μL；Akt抑制剂组和ERK抑制剂组均加入同前剂量与体积17β-雌二醇，另分别加入10 μmol/L LY294002和30 μmol/L PD98059各1 μL。分别于培养0(即刻)、24、48、72 h，每组取5孔细胞，用细胞计数试剂盒8与酶标仪检测细胞增殖活性。(3)取对数生长期HaCaT细胞，同前分组处理，每组3孔。培养72 h，用流式细胞仪检测细胞周期分布，计算细胞增殖指数(PI)。(4)取对数生长期HaCaT细胞，同前分组处理，每组3皿。培养72 h，蛋白质印迹法检测细胞中磷酸化Akt(p-Akt)、磷酸化ERK(p-ERK)和PCNA蛋白水平。细胞实验均重复3次。对数据行t检验、单因素方差分析、析因设计方差分析、LSD检验。结果 (1)卵巢切除组小鼠表皮厚度为(33.5±3.0)μm，明显薄于动情期组的(51.4±3.1)μm(t＝20.7，P<0.01)。2组小鼠PCNA阳性细胞主要集中于表皮基底层；卵巢切除组小鼠表皮中PCNA阳性细胞数为每200倍视野下(37±12)个，明显少于动情期组的每200倍视野下(96±15)个(t＝15.3，P<0.01)。(2)培养0～48 h，单纯雌二醇组与阴性对照组细胞增殖活性差异不明显(P值均大于0.05)。培养72 h，与阴性对照组比较，单纯雌二醇组细胞增殖活性明显增高(P<0.01)；Akt抑制剂组、ERK抑制剂组细胞增殖活性均明显低于前2组(P值均小于0.01)。(3)与阴性对照组的(51.6±1.1)%比较，单纯雌二醇组细胞PI明显升高[(58.5±0.8)%，P<0.05]；Akt抑制剂组、ERK抑制剂组细胞PI分别为(34.9±0.8)%、(48.2±0.4)%，均明显低于前2组(P值均小于0.01)。(4)与阴性对照组的0.566±0.034比较，单纯雌二醇组细胞p-Akt蛋白水平明显升高(1.048±0.077，P<0.01)；Akt抑制剂组和ERK抑制剂组细胞p-Akt蛋白水平分别为0.682±0.095、0.672±0.019，明显低于单纯雌二醇组(P值均小于0.01)。与阴性对照组的0.469±0.013比较，单纯雌二醇组、Akt抑制剂组、ERK抑制剂组细胞p-ERK蛋白水平均明显升高(1.064±0.089、1.010±0.038、0.778±0.065，P值均小于0.01)。与单纯雌二醇组比较，ERK抑制剂组细胞p-ERK蛋白水平明显降低(P<0.01)。与阴性对照组的0.386±0.053比较，单纯雌二醇组细胞的PCNA蛋白水平明显升高(0.743±0.043，P<0.01)；Akt抑制剂组和ERK抑制剂组细胞PCNA蛋白水平分别为0.264±0.019、0.223±0.065，明显低于前2组(P值均小于0.01)。结论雌激素缺乏时，小鼠表皮发育能力减弱。雌激素(17β-雌二醇)可通过激活ERK/Akt信号通路上调PCNA表达，以促进HaCaT细胞的增殖。

腺病毒介导的人表皮生长因子基因转染对人表皮细胞生物学特性的影响

尹凯, 马丽, 申传安, 尚玉茹, 李大伟, 李龙珠, 赵东旭, 程文凤

2016, 32(5): 305-311. doi: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2016.05.011

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摘要:
目的观察腺病毒介导的人EGF(Ad-hEGF)基因转染人表皮细胞的合适条件及转染对该细胞生物学特性的影响。方法取包皮环切术后弃用的新鲜人体包皮组织，通过酶消化法分离人表皮细胞，传代培养，采用第3代细胞进行以下实验。(1)按随机数字表法(分组方法下同)将细胞分为未转染组及5、20、50、100、150、200倍转染组，每组3孔。未转染组不转染Ad-hEGF基因，后6组分别按感染复数(MOI)5、20、50、100、150、200转染Ad-hEGF基因。转染24、48、72 h，倒置相差显微镜下观察细胞形态，倒置荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白表达。(2)另取3个批次细胞，分别同前分组处理，分别于转染24、48、72 h，流式细胞仪检测Ad-hEGF基因转染率(样本数为3)，ELISA法检测收集的细胞培养上清液中EGF质量浓度(样本数为6)，细胞计数试剂盒8(CCK8)及酶标仪检测细胞增殖活性(样本数为6)。(3)另取细胞分为未转染组和转染组，每组6孔。未转染组用未转染细胞的细胞培养上清液孵育，转染组用以最佳MOI(50)转染Ad-hEGF基因细胞的细胞培养上清液孵育，分别于孵育1、3、5 d，CCK8及酶标仪检测细胞分泌的EGF生物活性。(4)另取细胞分为未转染组和转染组，每组12孔。未转染组不转染Ad-hEGF基因，转染组以最佳MOI(50)转染Ad-hEGF基因。转染24 h，免疫荧光染色法检测细胞角蛋白14(CK14)、CK19表达。(5)另取细胞，同(4)分组(每组6孔)处理，于划痕后0(即刻)、12、24、48 h，倒置相差显微镜下观测细胞迁移距离。对数据行析因设计方差分析、重复测量方差分析、LSD检验。结果 (1)转染24、48 h，各转染组细胞形态与未转染组比较，无明显改变；转染72 h，200倍转染组的细胞碎片较未转染组明显增多。转染24、48、72 h，未转染组细胞未见绿色荧光蛋白表达，各转染组绿色荧光蛋白阳性细胞数随转染时间延长逐渐增多。(2)各转染组细胞Ad-hEGF基因转染率随转染时间延长逐渐增高。转染72 h，50～200倍转染组细胞Ad-hEGF基因转染率均大于90%；未转染组及5、20倍转染组细胞Ad-hEGF基因转染率则分别为(0.51±0.20)%、(62.44±6.23)%、(75.00±5.43)%，明显低于50倍转染组的(93.12±2.55)%，P值均小于0.01。随着转染时间的延长，各转染组细胞培养上清液中EGF质量浓度逐渐增高；转染72 h，50倍转染组细胞培养上清液中EGF质量浓度明显高于其余各组(P值均小于0.01)。转染24、48 h，各组细胞增殖活性相近(P值均大于0.05)；转染72 h，200倍转染组细胞增殖活性明显低于其余各组(P值均小于0.05)。(3)孵育1 d，2组细胞分泌的EGF生物活性相近(P>0.05)；孵育3、5 d，转染组细胞分泌的EGF生物活性明显高于未转染组(P值均小于0.01)。(4)转染24 h，转染组细胞CK14、CK19表达较未转染组增强。(5)划痕后0 h，2组细胞划痕宽度基本一致。划痕后12～48 h，转染组细胞迁移距离明显长于未转染组(P值均小于0.01)。结论 Ad-hEGF基因转染人表皮细胞的合适MOI为50～150，以50为最佳，以此MOI转染既能高效表达目的基因，又可保持细胞良好的增殖、分化和迁移能力。

受压深度烧伤创面并发大片乳头状瘤一例

金少华, 李传吉, 张龙, 齐旭辉, 张丽香

2016, 32(5): 312-313. doi: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2016.05.012

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一例高压电致全身多处毁损伤患者的护理