中华烧伤与创面修复杂志

目的探讨乳酸乳球菌温敏水凝胶对糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响及其机制。方法 (1)按照菌与培养基体积比为1∶100用M17GS液体培养基培养约5×10⁸集落形成单位/mL乳酸乳球菌(浓度下同)，分别于培养0(即刻)、2、4、6、8、10、12 h用酶标仪观测其生长情况。另取该菌菌落同前处理并于相同时间点收集培养基分离细菌培养上清液，用台式pH计测定pH值，并用L-乳酸检测分析试剂盒测定培养0(即刻)、2、4、8、12 h的L-乳酸浓度(样本数为3)。(2)将泊洛沙姆温敏聚合物与M17GS液体培养基按照质量与体积比为0.2 g∶1 mL充分混匀，制备单纯温敏水凝胶。按照菌与水凝胶体积比1∶100在单纯温敏水凝胶中加入乳酸乳球菌，充分混匀后制备乳酸乳球菌温敏水凝胶，分别在4、37 ℃孵育以及成胶后再4 ℃孵育观察其形态；通过流变仪测定乳酸乳球菌温敏水凝胶在10～40 ℃的储能模量与损耗模量，同时观察成胶温度；将乳酸乳球菌温敏水凝胶冷冻干燥后，通过扫描电子显微镜观察其表面及其中乳酸乳球菌的形态结构。(3)将小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞用终质量浓度分别为100、10 ng/mL内毒素/脂多糖与γ干扰素培养24 h刺激M1型极化，将细胞分为空白对照组(不做其他处理)、乳酸乳球菌温敏水凝胶组和乳酸组。乳酸乳球菌温敏水凝胶组细胞加入1 mL乳酸乳球菌温敏水凝胶，乳酸组细胞加入终物质的量浓度为30 mmol/L乳酸，37 ℃培养24 h后，通过实时荧光定量反转录PCR(RT-PCR)法检测M2型巨噬细胞标志物精氨酸酶1、CD206的mRNA表达量(样本数为3)，采用免疫荧光法检测精氨酸酶1和CD206的蛋白定位与表达。(4)取15只8～10周龄雌性BALB/c小鼠，通过链脲佐菌素联合高糖高脂饲料的方法诱导为糖尿病小鼠模型后，在每只小鼠背部制作直径6 mm全层皮肤缺损创面，采用随机数字表法将小鼠分为空白对照组(不做其他处理)、单纯温敏水凝胶组和乳酸乳球菌温敏水凝胶组，每组5只。水凝胶处理2组小鼠伤后即刻分别滴加200 μL相应水凝胶至创面，每天更换水凝胶。水凝胶处理2组小鼠处理0(即刻)、3、6、9、12 d后，观察创面愈合情况，测量创面面积；处理12 d后，取创面组织，行苏木精-伊红染色观察肉芽组织厚度，采用免疫荧光法观测CD206、M1型巨噬细胞标志物诱导型一氧化氮合酶(iNOS)阳性细胞。空白对照组小鼠于前述相同时间点进行相应观测。(5)取9只8～10周龄雌性BALB/c小鼠同实验(4)方法诱导糖尿病小鼠模型后，采用随机数字表法分为正常皮肤组(不做其他处理)、单纯创面组、乳酸乳球菌温敏水凝胶组，每组3只。单纯创面组与乳酸乳球菌温敏水凝胶组小鼠按照实验(4)方法制成全层皮肤缺损创面，前一组小鼠伤后不做其他处理，后一组小鼠伤后即刻滴加200 μL乳酸乳球菌温敏水凝胶至创面。水凝胶处理组小鼠处理1 d后，取创面组织，通过实时荧光定量RT-PCR法检测白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和核因子κB mRNA表达量；眼球取血后，通过全自动血细胞分析仪检测外周血白细胞计数、淋巴细胞计数和单核细胞计数，通过L-乳酸检测分析试剂盒测定血清L-乳酸浓度。于前述相同时间点，取正常皮肤组小鼠相应部位正常皮肤组织、单纯创面组小鼠创面组织及2组小鼠血液进行相应检测。对数据行单因素方差分析、重复测量方差分析、Tukey和Dunnett检验。结果 (1)乳酸乳球菌于培养约6 h生长达到平台期。乳酸乳球菌培养上清液中，pH值逐渐降低，至培养8 h下降至最低值4.9左右；L-乳酸浓度逐渐升高，至培养8 h达到最高值约70 mmol/L。(2)乳酸乳球菌温敏水凝胶在4 ℃为液体溶胶态，在37 ℃为固体凝胶态，成胶后于4 ℃孵育后再次变为液体溶胶态；成胶温度约为25 ℃，成胶后储能模量约为3 000 Pa、损耗模量约为1 000 Pa。扫描电子显微镜下可见，乳酸乳球菌温敏水凝胶为疏松三维多孔结构，乳酸乳球菌为椭球形并被包裹在水凝胶内部。(3)培养24 h，与空白对照组比较，乳酸乳球菌温敏水凝胶组、乳酸组巨噬细胞中精氨酸酶1表达量显著升高(

q

＝11.620、15.250，

P

<0.01)、CD206 mRNA表达量显著升高(

q

＝16.770、19.030，

P

<0.01)，定位于细胞膜的CD206蛋白和定位于细胞质的精氨酸酶1蛋白表达明显升高；乳酸组巨噬细胞中精氨酸酶1、CD206 mRNA表达量与乳酸乳球菌温敏水凝胶组相近(

q

＝3.629、2.259，

P

>0.05)。(4)处理3～12 d后，与空白对照组和单纯温敏水凝胶组比较，乳酸乳球菌温敏水凝胶组小鼠创面愈合速度更快，创面面积明显缩小，创缘炎症减轻。乳酸乳球菌温敏水凝胶组小鼠处理3、6、9、12 d后创面面积[(25.8±5.9)、(21.2±4.6)、(16.0±2.4)、(8.4±2.4)mm²]较空白对照组[(31.8±5.3)、(28.0±3.4)、(22.6±3.7)、(17.0±1.0)mm²]显著缩小(

q

＝3.506、3.973、3.856、5.025，

P

<0.05或

P

<0.01)，处理3、6 d后创面面积较单纯温敏水凝胶组显著缩小(

q

＝3.739、3.739，

P

<0.05)。处理12 d后，与空白对照组和单纯温敏水凝胶组比较，乳酸乳球菌温敏水凝胶组小鼠创面肉芽组织更厚，创面组织中iNOS阳性细胞明显减少且CD206阳性细胞明显增多。(5)处理1 d后，单纯创面组小鼠创面组织中IL-1β、TNF-α和核因子κB mRNA表达量显著高于正常皮肤组小鼠正常皮肤组织(

q

＝9.253、4.819、6.020，

P

<0.01)，与乳酸乳球菌温敏水凝胶组相近(

q

＝2.850、2.735、2.556，

P

>0.05)；单纯创面组小鼠外周血白细胞计数、淋巴细胞计数与单核细胞计数显著高于正常皮肤组(

q

＝3.523、5.373、5.279，

P

<0.05或

P

<0.01)，与乳酸乳球菌温敏水凝胶组相近(

q

＝0.621、1.240、1.293，

P

>0.05)；3组小鼠血清L-乳酸浓度均保持在正常范围内且组间总体比较差异无统计学意义(

F

＝4.095，

P

>0.05)。结论乳酸乳球菌温敏水凝胶在糖尿病全层皮肤缺损小鼠创面局部使用安全，能够通过原位生产投递乳酸，促进巨噬细胞从M1型向M2型极化，重塑创面愈合微环境，促进创面的高效愈合。

猪膀胱脱细胞基质和猪脱细胞真皮基质对糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响

赵朋, 杨敏烈, 储国平, 贾志刚, 周小金, 吕国忠

2020, 36(12): 1130-1138. doi: 10.3760/cma.j.cn501120-20200901-00399

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摘要:

目的对比猪膀胱脱细胞基质(UBM)和猪脱细胞真皮基质(ADM)对糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面促愈合效果的差异。方法将36只10周龄雄性2型糖尿病BKS db/db小鼠按照随机数字表法分为UBM组和ADM组，每组18只，术前非空腹血糖物质的量浓度大于16.6 mmol/L，于每只小鼠背部制作直径6 mm圆形全层皮肤缺损创面，相应植入猪UBM和猪ADM支架。术后即刻及7、14、28 d，行创面大体观察。术后7、14和28 d，每组各取小鼠6只计算创面上皮化率，计算后处死相应小鼠，取创面组织制作切片。收集2组小鼠术后7与14 d各6张切片行苏木精-伊红(HE)染色、术后7与28 d各6张切片行Masson染色，观察组织病理学变化及支架降解情况。收集2组小鼠术后7、14 d各24张切片，采用免疫组织化学法检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和CD31阳性表达量，以分别反映肌成纤维细胞(Fb)、新生血管生长情况；观察巨噬细胞的分布和活化。取2组小鼠术后7、14 d创面组织，采用实时荧光定量反转录PCR法检测成纤维细胞生长因子2(FGF-2)、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子β₁(TGF-β₁)mRNA含量。上述指标每组各时间点样本数为6。对数据行析因设计方差分析、

t

检验及Bonferroni校正。结果 (1)大体观察显示，UBM组小鼠创面术后大部分时间点与UBM支架融合佳，ADM组小鼠创面术后大部分时间点与ADM支架融合差；术后28 d，ADM组小鼠创面支架表面部分区域仍未形成表皮，UBM组小鼠创面完全上皮化。术后7、14和28 d，UBM组小鼠创面上皮化率分别为(22.4±6.4)%、(68.6±12.4)%、100.0%，均明显高于ADM组[(4.5±2.2)%、(23.6±4.6)%、(64.2±13.2)%，

t

＝7.427、9.665、7.655，

P

<0.01]。(2)HE染色和Masson染色显示，术后7 d，UBM组小鼠创面支架出现大量细胞；术后14 d，细胞占据UBM支架的全部区域；术后28 d，创面形成与正常皮肤结构类似的真皮组织，并且UBM支架原有的纤维形态消失。术后7 d，ADM组小鼠创面支架内部仅出现少量细胞；术后14 d，细胞散布于ADM支架之中；术后28 d，ADM支架原有粗大的胶原纤维形态仍清晰可见。(3)术后7 d，UBM组小鼠创面支架底层出现大量聚集的肌Fb，出现新生血管；术后14 d，UBM支架上层出现均匀分布的肌Fb、新生血管，并且大部分血管实现灌注。术后7、14 d，ADM组小鼠创面支架中仅散在分布肌Fb，无或少量未明显灌注的新生管腔结构。术后7、14 d，UBM组小鼠创面支架中α-SMA阳性表达量明显高于ADM组(

t

＝25.340、6.651,

P

<0.01)，CD31阳性表达量也明显高于ADM组(

t

＝34.225、10.581,

P

<0.01)。(4)术后7 d，UBM组小鼠创面支架底层出现大量巨噬细胞；术后14 d，巨噬细胞迁入UBM支架内部，发生M2型极化、无M1型极化。术后7 d，ADM组小鼠创面支架底部出现少量巨噬细胞；术后14 d，ADM支架内部巨噬细胞稀少，未发生M2型或M1型极化。(5)术后7、14 d，UBM组小鼠创面组织中FGF-2、VEGF、PDGF和TGF-β₁的mRNA表达量均明显高于ADM组(

t

＝7.007、14.770、10.670、8.939，7.174、7.770、4.374、4.501,

P

<0.01)。结论猪UBM支架通过诱导肌Fb和巨噬细胞迁入、促血管新生与促愈合生长因子的表达，促进糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面的修复和真皮重建，效果优于猪ADM。

氧化铜纳米酶对糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面修复的作用及其机制

彭源, 卢毅飞, 邓君, 张艳

2020, 36(12): 1139-1148. doi: 10.3760/cma.j.cn501120-20200929-00426

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摘要:
目的探讨氧化铜纳米酶对糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面修复的作用及其机制。方法 (1)采用氯化铜与L-抗坏血酸反应的方法合成氧化铜纳米酶。采用透射电子显微镜观察氧化铜纳米酶大小和形貌，动态光散射粒度分析仪和纳米粒度电位仪分别分析其水合粒径和表面电位。(2)采用过氧化氢检测试剂盒、超氧阴离子检测试剂盒、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺显色剂分别测定150 ng/mL氧化铜纳米酶的过氧化氢、超氧阴离子、羟自由基清除能力，计算过氧化氢、超氧阴离子、羟自由基清除比例(样本数均为3)。(3)将小鼠成纤维细胞系3T3细胞采用随机数字表法(分组方法下同)分为空白对照组、单纯过氧化氢组和过氧化氢＋氧化铜组，每组3孔。将终质量浓度25 ng/mL的氧化铜纳米酶加入过氧化氢＋氧化铜组细胞中预处理30 min。然后，在单纯过氧化氢组和过氧化氢＋氧化铜组细胞中各加入终物质的量浓度250 μmol/L过氧化氢，空白对照组常规培养。培养24 h后，采用2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯荧光探针检测细胞内活性氧水平(以绿色荧光强度表示)，细胞计数试剂盒8法检测并计算细胞存活率。(4)取10只6～8周龄雄性BALB/c小鼠(性别、鼠龄下同)，分为磷酸盐缓冲液(PBS)组与氧化铜组，每组5只。氧化铜组小鼠经尾静脉注射200 ng/mL的氧化铜纳米酶800 ng/kg，PBS组小鼠注射等体积的PBS。2组小鼠均每天注射1次，连续注射7 d。于第8天，取每组5只小鼠，采血行血细胞与血清生化分析，处死后收集心、肝、脾、肺和肾行苏木精-伊红(HE)染色后组织病理学观察。(5)取20只小鼠分为PBS组与氧化铜组，每组10只。采用链脲佐菌素及高糖高脂饮食法诱导糖尿病，并在其背部制作直径6 mm的全层皮肤缺损创面。伤后即刻，PBS组小鼠创面滴加20 μL PBS，氧化铜组小鼠创面滴加20 μL 200 ng/mL的氧化铜纳米酶，连续处理12 d。每组选定3只小鼠分别于伤后0(即刻)、3、6、9、12 d观察创面愈合情况，并计算创面未愈合面积。伤后6 d，每组取未行创面观察的3只小鼠，处死后酶联免疫吸附测定法测定创面组织中白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-6含量。伤后12 d，处死2组各剩余7只小鼠，行HE染色并观察创面新生上皮长度，行二氢乙锭荧光探针染色观察活性氧水平(以红色荧光强度表示)。对数据行单因素方差分析、重复测量方差分析、独立样本t检验、Bonferroni检验。结果 (1)制备的氧化铜纳米酶大小均匀，在干燥状态下平均直径为3.5～4.0 nm，水合粒径约为4.5 nm，表面电位为(-9.8±0.3)mV。综合判定，成功制备了氧化铜纳米酶。(2)氧化铜纳米酶分别处理2 h、10 min、5 min后，过氧化氢、超氧阴离子、羟自由基清除比例分别为(77±5)%、(45±5)%、(84±4)%。(3)培养24 h后，单纯过氧化氢组细胞内活性氧水平急剧增高，细胞形态异常且数量减少；过氧化氢＋氧化铜组细胞内活性氧水平明显降低，细胞形态与空白对照组相比无明显变化。单纯过氧化氢组细胞存活率明显低于空白对照组和过氧化氢＋氧化铜组(P<0.01)，而过氧化氢＋氧化铜组细胞存活率与空白对照组相近。(4)注射7 d后，PBS组和氧化铜组小鼠肝功能指标、肾功能指标、血细胞相关指标均相近；氧化铜组小鼠的心、肝、脾、肺和肾中，均未观察到组织坏死、充血或出血，与PBS组无明显差别。(5)氧化铜组小鼠创面相比PBS组表现出更快的愈合趋势，创面红肿情况较轻。氧化铜组小鼠伤后6、9、12 d创面未愈合面积分别为(28.8±1.9)、(17.6±3.8)、(10.4±1.8)mm²，明显小于PBS组的(38.0±4.3)、(30.2±3.0)、(24.2±3.0)mm²(t＝3.706、5.075、5.558，P<0.01)。伤后6 d，氧化铜组小鼠创面IL-1β、TNF-α、IL-6含量均明显低于PBS组(t＝6.115、11.762、11.725，P<0.01)。伤后12 d，氧化铜组小鼠创面新生上皮长度长于PBS组，创面组织活性氧水平明显低于PBS组。结论氧化铜纳米酶不仅具有良好的生物相容性，同时具有高效的活性氧清除活性，能够消除糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面过量表达的活性氧，降低氧化应激、减轻炎症，促进创面修复。

不同模式持续负压伤口疗法对下肢静脉性溃疡创面的临床疗效及其影响因素前瞻性随机对照研究

杨敏烈, 周小金, 朱宇刚, 姜东林, 丁羚涛, 储国平, 赵朋, 程佳, 吕国忠, 李青峰

2020, 36(12): 1149-1158. doi: 10.3760/cma.j.cn501120-20200316-00173

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摘要:
目的探讨不同模式持续负压伤口疗法(NPWT)对下肢静脉性溃疡创面的临床疗效并进行影响因素分析。方法 2018年1月—2019年12月，江南大学附属医院收治53例符合入选标准的下肢静脉性溃疡患者，对其进行前瞻性随机对照研究。按随机数字表法将患者分为单一负压治疗组19例(男11例、女8例)、循环交替负压治疗组17例(男12例、女5例)和常规换药组17例(男10例、女7例)，年龄分别为(47±11)、(49±10)、(47±10)岁。入院后，单一负压治疗组患者接受负压为-13.3 kPa单一负压模式持续NPWT，循环交替负压治疗组患者接受负压为-16.0～-10.7 kPa循环交替负压模式持续NPWT，常规换药组患者接受碘伏浸润的凡士林纱布换药治疗。治疗7、14 d，计算创面愈合率；治疗前及治疗7、14 d，采用经皮氧分压(TcPO₂)测量仪检测创周TcPO₂；治疗1、4、7、10、14 d，收集创面渗出液/引流液，采用pH计行pH值检测并记录渗出液/引流液量；治疗前及治疗7、14 d，采集静脉血，检测血清白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、转化生长因子β₁(TGF-β₁)、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)水平；治疗前及治疗7、14 d，采集创面分泌物行细菌培养，分别采用视觉模拟评分法和汉密尔顿焦虑量表评定患者创面疼痛和焦虑程度；统计患者住院时间及治疗总费用。对数据进行重复测量方差分析、单因素方差分析、LSD检验、Kruskal-Wallis H检验、Mann-Whitney U检验、χ²检验、Fisher确切概率法检验以及Bonferroni校正。根据治疗14 d创面愈合率，分创面愈合率≥70%的显著愈合和创面愈合率<70%的非显著愈合2个疗效评价等级，以此二分类的创面愈合率为因变量，以治疗前TcPO₂、IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β₁、VEGF、bFGF水平与细菌检出情况、创面疼痛和焦虑程度及治疗1 d创面渗出液/引流液量和pH值为协变量，通过二分类多因素logistic回归分析，分析影响创面显著愈合的危险因素。结果 (1)治疗7 d，单一负压治疗组患者创面愈合率为(33±10)%，明显高于常规换药组的(24±9)%(P<0.05)；治疗14 d，单一负压治疗组、循环交替负压治疗组患者创面愈合率分别为(71±15)%、(66±18)%，均显著高于常规换药组的(45±19)%(P<0.01)。(2)与常规换药组比较，单一负压治疗组患者治疗14 d及循环交替负压治疗组患者治疗7、14 d创周TcPO₂明显升高(P<0.05或P<0.01)；单一负压治疗组患者治疗10、14 d及循环交替负压治疗组患者治疗7、14 d创面引流液pH值明显降低(P<0.05)；单一负压治疗组患者治疗10、14 d及循环交替负压治疗组患者治疗7、10、14 d创面引流液的量明显减少(Z＝-4.060、-4.954，-2.413、-4.085、-4.756，P<0.05或P<0.01)；单一负压治疗组、循环交替负压治疗组患者治疗7、14 d血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著降低(P<0.01)，循环交替负压治疗组患者治疗14 d血清TGF-β₁水平显著升高(P<0.05)，单一负压治疗组、循环交替负压治疗组患者治疗14 d血清VEGF、bFGF水平显著升高(P<0.01)；单一负压治疗组、循环交替负压治疗组患者治疗7、14 d创面分泌物细菌检出比例、创面疼痛及焦虑评分均显著降低(P<0.01)。负压治疗2组比较，除治疗7 d循环交替负压治疗组患者创面疼痛评分明显低于单一负压治疗组(P<0.01)外，前述其余指标均相近。(3)单一负压治疗组与循环交替负压治疗组患者住院时间相近(P>0.05)，均显著短于常规换药组(P<0.01)；3组患者治疗总费用相近(F＝1.766，P>0.05)。(4)治疗前血清TNF-α与bFGF水平、创周TcPO₂、创面疼痛程度为影响创面显著愈合的危险因素(比值比＝1.109、0.950、1.140、2.169，95%置信区间＝1.012～1.217、0.912～0.988、1.008～1.290、1.288～3.651，P<0.05或P<0.01)。结论临床应用单一负压模式和循环交替负压模式持续NPWT对下肢静脉性溃疡创面创基改善、提高愈合率均有积极的促进作用，但循环交替负压模式较单一负压模式更快改善创周TcPO₂、更快降低创面pH值、更快减少渗液量、缓解疼痛效果更显著；治疗前血清TNF-α与bFGF水平、创周TcPO₂、创面疼痛程度是影响创面显著愈合的危险因素。

基于16S核糖体RNA高通量测序的特重度烧伤患者肠道菌群动态变化分析

潘艳艳, 范友芬, 李吉良, 崔胜勇, 黄能, 晋国营, 陈粹, 张淳

2020, 36(12): 1159-1166. doi: 10.3760/cma.j.cn501120-20200518-00271

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摘要:
目的基于16S核糖体RNA(rRNA)高通量测序分析特重度烧伤患者肠道菌群的动态变化规律。方法本前瞻性观察性研究纳入2017年2—6月中国科学院大学宁波华美医院收治的符合入选标准的5例男性特重度烧伤患者(年龄32～48岁)，采集其休克期(伤后3 d内)、急性感染早期(伤后4～14 d)、急性感染中期(伤后15～28 d)、急性感染后期(伤后29 d至出院前1周)及出院前1周内的粪便样本，各时期样本数均为5。使用pH计测定粪便样本的pH值，高通量测序技术对粪便样本的16S rRNA V3、V4区进行测序。QIIME分析软件分析肠道菌群操作分类单元(OTU)数目、α多样性(Chao1指数、Shannon指数)和门、科的相对丰度，非加权组平均法聚类分析肠道菌群β多样性，Tax4Fun预测肠道菌群功能变化。对数据行单因素重复测量方差分析、Bonferroni法、配对样本Wilcoxon秩和检验及Bonferroni校正。结果 (1)本组特重度烧伤患者急性感染早、中期粪便pH值分别为7.40±0.45、7.56±0.45，明显高于休克期的6.68±0.36(P<0.05或P<0.01)。(2)共获得2 333 584条有效高质量序列，序列长度为415 bp左右，共获得1 209个OTU，所有标本测序覆盖度均达99.0%以上。本组特重度烧伤患者急性感染早、中、后期OTU数目、Chao1指数明显低于休克期(Z值均为2.023，P<0.05)；出院前1周内OTU数目、Chao1指数明显高于急性感染早、中、后期，Shannon指数明显高于急性感染早、中期(Z值均为2.023，P<0.05)。(3)本组特重度烧伤患者休克期样本菌群结构与出院前1周内相似度高，与急性感染早、中、后期相似度低。各个单独样本的分析显示，大部分样本聚类规律与分期样本一致。休克期肠道菌群加权Unifrac距离明显短于急性感染早、中、后期(Z＝3.326、2.570、2.690，P<0.05或P<0.01)，其他时期肠道菌群加权Unifrac距离相近。(4)门水平上，与休克期比较，急性感染早、中、后期厚壁菌门细菌相对丰度降低，变形菌门和拟杆菌门细菌相对丰度升高；上述3个菌门细菌相对丰度在出院前1周内与休克期相近。伤后不同时期科水平上相对丰度前5的优势菌有较大差异，休克期的前5优势科细菌相对丰度在急性感染早、中、后期降低。休克期的非优势科如肠杆菌科、链球菌科、拟杆菌科细菌相对丰度在急性感染早、中、后期大幅升高，成为这些时期新的优势科；出院前1周内部分产酸菌科细菌相对丰度恢复至接近休克期水平。(5)急性感染早、中期肠道菌群的某些氨基酸代谢、糖酵解和糖异生、丙酮酸代谢等功能较休克期减弱，急性感染后期肠道菌群某些氨基酸和糖类代谢较休克期增强，休克期与出院前1周内肠道菌群功能基因分布相似。结论特重度烧伤患者肠道内环境及菌群结构在急性感染早、中期发生了明显变化，pH值升高，菌群种类及多样性减少，尤其是产酸菌科细菌的相对丰度明显降低，但随着患者治疗结束而恢复。可考虑将粪便pH值和肠道变形菌门及产酸菌科细菌变化作为反映特重度烧伤患者肠道菌群紊乱水平的指标。

血常规指标及其比值对成年大面积烧伤患者预后的判断价值

郑建军, 王子恩, 郑林文, 许钊荣, 陈舜, 陈昭宏

2020, 36(12): 1167-1172. doi: 10.3760/cma.j.cn501120-20200308-00133

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目的分析中性粒细胞与淋巴细胞比值(NLR)、血小板与淋巴细胞比值(PLR)、血小板计数(BPC)对成年大面积烧伤患者预后的判断价值。方法 2012年1月—2018年12月，福建医科大学附属协和医院收治符合入选标准的99例成年大面积烧伤患者[男76例、女23例，年龄18～75(43±13)岁]。根据预后，将患者分为存活组79例和死亡组20例，以病例对照研究的方法回顾性分析其临床资料。统计2组患者的性别、年龄、烧伤总面积、合并吸入性损伤和行机械通气情况，及伤后第1、3、7天白细胞计数、中性粒细胞计数、淋巴细胞计数、BPC，并计算NLR、PLR、伤后第3天与伤后第1天BPC的差值ΔBPC3、伤后第3天与伤后第1天NLR的差值ΔNLR3、伤后第3天与伤后第1天PLR的差值ΔPLR3、伤后第7天与伤后第1天BPC的差值ΔBPC7、伤后第7天与伤后第1天NLR的差值ΔNLR7、伤后第7天与伤后第1天PLR的差值ΔPLR7。对数据行Mann-Whitney U检验、独立样本t检验、χ²检验，筛选患者死亡的相关因素，通过二分类单因素和多因素logistic回归分析，分析患者死亡的相关因素。绘制患者死亡的独立危险因素对成年大面积烧伤患者预后预测的受试者工作特征(ROC)曲线，计算曲线下面积及最佳阈值与最佳阈值下的敏感度、特异度。结果 (1)2组患者烧伤总面积、行机械通气情况比较，差异有统计学意义(Z＝-2.615、χ²＝7.282，P<0.01)。(2)伤后第1天，2组患者NLR比较，差异有统计学意义(Z＝-2.414，P<0.05)。伤后第3天，2组患者BPC、ΔNLR3比较，差异均有统计学意义(Z＝-2.048、-2.780，P<0.05或P<0.01)。伤后第7天，2组患者淋巴细胞计数、BPC、NLR、ΔNLR7比较，差异均有统计学意义(Z＝-2.248、-2.231、-2.641、-3.669，P<0.05或P<0.01)。(3)二分类单因素logistic回归分析显示，烧伤总面积、机械通气、伤后第7天BPC和NLR、ΔNLR7与患者死亡相关(比值比＝1.038、0.193、0.990、1.086、1.105，95%置信区间＝1.010～1.067、0.062～0.598、0.982～0.998、1.012～1.165、1.037～1.178，P<0.05或P<0.01)；二分类多因素logistic回归分析显示，ΔNLR7是成年大面积烧伤患者死亡的独立危险因素(比值比＝1.090，95%置信区间＝1.008～1.178，P<0.05)。(4)ΔNLR7对97例成年大面积烧伤患者预后死亡预测的ROC曲线最佳阈值为-0.073 4，最佳阈值下的敏感度为65.0%、特异度为78.5%，ROC曲线下面积为0.776(95%置信区间＝0.650～0.882，P<0.01)。结论动态监测NLR、BPC对协助判断成年大面积烧伤患者的预后有重要意义，ΔNLR7是成年大面积烧伤患者死亡事件的独立预测指标，而PLR不能很好地预测成年大面积烧伤患者的预后。

去甲肾上腺素对小鼠骨髓间充质干细胞迁移的影响及其机制

孔亚男, 金晶, 程飚

2020, 36(12): 1173-1182. doi: 10.3760/cma.j.cn501120-20200325-00194

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目的探讨交感神经递质去甲肾上腺素(NE)对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)迁移的影响及其机制。方法 (1)取20只3周龄雄性C57BL/6小鼠，处死后取出股骨和胫骨，分离培养BMSC并鉴定。取第2代或3代细胞，分为磷酸盐缓冲液(PBS)组、1 μmol/L NE组、10 μmol/L NE组及100 μmol/L NE组，每组8孔。1 μmol/L NE组、10 μmol/L NE组及100 μmol/L NE组细胞分别在含体积分数1%胎牛血清的低糖DMEM培养基(以下简称低血清培养基)内分别加入终物质的量浓度为1、10、100 μmol/L的NE培养，PBS组细胞在低血清培养基内加入等体积的PBS培养。在刺激前(0 d)及刺激1、3、5 d，采用细胞计数试剂盒8法检测细胞增殖活性(以吸光度值表示)。(2)细胞划痕试验1中，取细胞分为PBS组和单纯NE组，行划痕试验后，单纯NE组细胞采用低血清培养基＋终物质的量浓度为10 μmol/L的NE培养，PBS组细胞采用低血清培养基＋等体积PBS培养。细胞划痕试验2中，取细胞分为PBS组、普萘洛尔＋NE组、酚妥拉明＋NE组，行划痕试验后，普萘洛尔＋NE组细胞每天采用低血清培养基＋终物质的量浓度为1 μmol/L的普萘洛尔、酚妥拉明＋NE组细胞每天采用低血清培养基＋终物质的量浓度为10 μmol/L的酚妥拉明预处理30 min后，均再采用低血清培养基＋终物质的量浓度为10 μmol/L的NE培养；PBS组采用低血清培养基＋等体积PBS培养。细胞划痕试验3中，取细胞分为单纯NE组、单纯(2E，6E)-2，6-二(4-吡啶基亚甲基)环己酮(SC-66)组、SC-66＋NE组，行划痕试验后，单纯NE组采用低血清培养基＋终物质的量浓度为10 μmol/L的NE培养；单纯SC-66组细胞每天采用终物质的量浓度为30 mmol/L的SC-66预处理30 min后，再采用低血清培养基培养；单纯SC-66＋NE组每天采用终物质的量浓度为30 mmol/L的SC-66预处理30 min后，再采用低血清培养基＋终物质的量浓度为10 μmol/L的NE培养。以上3个细胞划痕试验，每组样本数均为6，均计算划痕后24、48、72 h的划痕愈合率。(3)取细胞分为PBS组、单纯NE组、普萘洛尔＋NE组、酚妥拉明＋NE组，每组3孔，PBS组、单纯NE组下室处理分别同细胞划痕试验1相同组，普萘洛尔＋NE组和酚妥拉明＋NE组下室处理分别同细胞划痕试验2相同组，行Transwell实验。常规培养24 h后，计数迁移细胞。(4)取细胞分为PBS组、单纯NE组、普萘洛尔＋NE组、酚妥拉明＋NE组，每组2皿，PBS组、单纯NE组细胞处理分别同细胞划痕试验1相同组，普萘洛尔＋NE组和酚妥拉明＋NE组细胞处理分别同细胞划痕试验2相同组。常规培养24 h后，采用蛋白质印迹法检测细胞蛋白激酶B(Akt)磷酸化水平。对数据行重复测量方差分析、单因素方差分析、独立样本t检验、LSD-t检验、Bonferroni校正。结果 (1)刺激1 d，100 μmol/L NE组细胞吸光度值明显低于PBS组(t＝2.986，P<0.05)；刺激5 d，10 μmol/L NE组细胞吸光度值明显高于PBS组(t＝3.547，P<0.01)。(2)细胞划痕试验1中，划痕后24、48、72 h，单纯NE组细胞划痕愈合率分别为(34.4±3.4)%、(52.5±4.7)%、(70.0±3.8)%，明显低于PBS组的(44.1±4.2)%、(80.0±3.6)%、(95.9±2.2)%(t＝19.320、128.319、221.575，P<0.01)。细胞划痕试验2中，划痕后24、48、72 h，普萘洛尔＋NE组细胞划痕愈合率均明显低于PBS组(t＝4.073、9.618、15.272，P<0.01)。细胞划痕试验3中，划痕后72 h，单纯NE组细胞划痕愈合率明显低于单纯SC-66组(t＝8.862，P<0.01)；划痕后24、48、72 h，SC-66＋NE组细胞划痕愈合率均明显低于单纯SC-66组(t＝3.862、4.290、10.357，P<0.01)。(3)Transwell实验显示，培养24 h，单纯NE组、普萘洛尔＋NE组及酚妥拉明＋NE组细胞迁移数量均明显少于PBS组(t＝11.895、10.196、3.222，P<0.01)。(4)培养24 h后，与PBS组比较，单纯NE组、普萘洛尔＋NE组细胞Akt磷酸化水平明显升高(t＝8.186、5.996，P<0.01)。结论 NE可抑制小鼠BMSC迁移，Akt信号通路参与了此调控过程。

黄芪甲苷对人内皮祖细胞分泌外泌体及表达微小RNA-126的影响

熊武, 白雪, 肖慧, 兰宏伟, 朱晨鸿, 赵世情, 吴玉娟, 陈佳

2020, 36(12): 1183-1190. doi: 10.3760/cma.j.cn501120-20191222-00466

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目的探讨黄芪甲苷对人内皮祖细胞(EPC)分泌外泌体及外泌体中微小RNA-126(miRNA-126)表达的影响。方法取湖南中医药大学第一附属医院妇产科2019年出生的1名足月健康新生儿脐带血，采用密度梯度离心法分离单个核细胞并培养7 d，其间行形态学观察；取第3代细胞，采用CD31免疫磁珠分选法和双荧光染色法鉴定。将鉴定成功的EPC按照随机数字表法分为黄芪甲苷组和磷酸盐缓冲液(PBS)组。黄芪甲苷组细胞加入终质量浓度100 mg/L的黄芪甲苷培养24 h，PBS组细胞加入等体积的PBS培养24 h。培养结束后收集2组细胞培养上清液中的外泌体，采用蛋白质印迹法检测外泌体特征性标志物CD9、CD63和CD81表达，于透射电子显微镜下观察EPC外泌体(EPC-Exo)形态，采用纳米颗粒跟踪分析技术检测EPC-Exo的粒径，采用二辛丁酸法测定EPC-Exo的浓度(样本数为3)，采用反转录PCR法测定EPC-Exo中与血管新生相关miRNA-126-3p和miRNA-126-5p的表达(样本数为3)。对数据行独立样本t检验。结果 (1)培养第4天，细胞开始贴壁生长，圆形、梭形、条形等多形态同时出现；继续培养至第7天时，细胞边缘清晰，呈铺路石样排列，中央细胞呈圆形，周边细胞呈梭形。(2)CD31免疫磁珠分选法显示细胞膜染绿色，细胞核染蓝色；双荧光染色法显示细胞呈橙黄色。经以上鉴定，细胞被证实为EPC。(3)培养24 h，2组EPC-Exo的CD9、CD63和CD81表达均呈阳性，证实本实验已成功提取EPC-Exo。(4)培养24 h，2组EPC-Exo均呈圆形膜囊泡，形态无明显差异。(5)培养24 h，黄芪甲苷组中98.7%的EPC-Exo粒径为84.7～143.1 nm，PBS组中98.0%的EPC-Exo粒径为88.7～123.5 nm。(6)培养24 h，黄芪甲苷组EPC-Exo的质量浓度为(310±5)μg/mL，明显高于PBS组的(257±5)μg/mL，t＝13.369，P<0.01。(7)培养24 h，黄芪甲苷组EPC-Exo中miRNA-126-3p(t＝16.062，P<0.01)和miRNA-126-5p(t＝3.252，P<0.05)均明显多于PBS组。结论黄芪甲苷可改善人EPC分泌外泌体的功能，且所分泌的外泌体负载miRNA-126。

曲安奈德联合5-氟尿嘧啶与单独曲安奈德治疗瘢痕疙瘩效果的荟萃分析

刘欣健, 崔正军, 张树堂, 苏卫国, 孟庆楠, 郭鹏飞, 魏爱周, 周健, 王常印, 邹仕波, 孙佳琳, 王旭

2020, 36(12): 1191-1198. doi: 10.3760/cma.j.cn501120-20190930-00390

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目的应用荟萃分析方法比较曲安奈德联合5-氟尿嘧啶与单独曲安奈德治疗瘢痕疙瘩的有效性和安全性。方法以"曲安奈德、瘢痕疙瘩、5-氟尿嘧啶、糖皮质激素、增生性瘢痕"为检索词检索《中国期刊全文数据库》《中国生物医学文献数据库》《万方数据库》，以"triamcinolone acetonide、5-fluorouracil、glucocorticoid、fluorouracil、keloid、scar、TAC、5-FU、hypertrophic scar"为检索词检索《PubMed》《Embase》《Cochrane Library》数据库。检索各数据库自建库至2019年8月公开发表的比较曲安奈德联合5-氟尿嘧啶和单独曲安奈德治疗瘢痕疙瘩的随机对照试验。结局指标包括治疗有效比例、不良反应发生比例、瘢痕疙瘩复发比例。采用RevMan 5.3和Stata 14.0统计软件对符合入选标准的研究进行荟萃分析。结果共纳入14篇文献1 326例瘢痕疙瘩患者，包括采用曲安奈德联合5-氟尿嘧啶瘢痕疙瘩内注射的曲安奈德＋5-氟尿嘧啶组患者668例，仅采用曲安奈德瘢痕疙瘩内注射的单纯曲安奈德组患者658例。改良Jadad评分1～3分的文献7篇、4～7分的文献7篇。曲安奈德＋5-氟尿嘧啶组患者的治疗有效比例明显高于单纯曲安奈德组[相对危险度(RR)＝1.28，95%置信区间＝1.16～1.41，P<0.01]。亚组分析显示，纳入文献质量高低和人种因素可能是治疗有效比例的异质性来源。曲安奈德＋5-氟尿嘧啶组患者的不良反应发生比例明显低于单纯曲安奈德组(RR＝0.44，95%置信区间＝0.25～0.75，P<0.01)。曲安奈德＋5-氟尿嘧啶组患者的瘢痕疙瘩复发比例明显低于单纯曲安奈德组(RR＝0.25，95%置信区间＝0.14～0.44，P<0.01)。不良反应发生比例不存在发表偏倚(P>0.05)，治疗有效比例、瘢痕疙瘩复发比例存在发表偏倚(P<0.05)。结论曲安奈德联合5-氟尿嘧啶皮下注射治疗瘢痕疙瘩的疗效优于单独应用曲安奈德，且不良反应和复发更少。

适用于软硬肌肉骨骼组织界面的韧性可调支架-水凝胶复合生物材料

杨雷(译者), 罗高兴(审校者)

2020, 36(12): 1166-1166. doi: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2020.12.101

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可注射的具有氧化还原和光反应性的二氧化锰混合水凝胶同时治疗黑色素瘤和多药耐药细菌感染创面

杨雷(译者), 罗高兴(审校者)

2020, 36(12): 1182-1182. doi: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2020.12.103

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摘要:

干燥人羊膜用作Ⅲ度烧伤处全层皮肤切除后创面敷料的研究

刘梦龙(译者), 罗高兴(审校者)

2020, 36(12): 1182-1182. doi: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2020.12.102

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摘要:

抗细菌生物膜水溶性纤维敷料对已使用传统抗菌敷料和全身抗菌药物处理的难愈性创面的临床影响

刘梦龙(译者), 罗高兴(审校者)

2020, 36(12): 1190-1190. doi: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2020.12.104

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摘要:

生物三维打印墨水硬度调控间充质干细胞命运决定的研究

2020, 36(12): 1198-1198. doi: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2020.12.105

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摘要:

巨噬细胞在增生性瘢痕及瘢痕疙瘩形成过程中的作用

2020, 36(12): 1203-1203. doi: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2020.12.106

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摘要:

背阔肌肌皮瓣修复较大软组织缺损的方法及供区继发创面的处理

马超, 陶然, 舒军, 雷永红, 韩岩

2020, 36(12): 1199-1203. doi: 10.3760/cma.j.cn501120-20191121-00439

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目的探讨背阔肌肌皮瓣修复较大软组织缺损的方法以及供区继发创面的处理。方法 2015年6月—2019年6月，解放军总医院第一医学中心收治各种原因所致软组织缺损或增生性瘢痕患者30例，其中男10例、女20例，年龄25～64岁，包括肿瘤生长及破溃导致头顶部软组织缺损患者18例、躯干及四肢增生性瘢痕患者7例、外伤导致面颈部软组织缺损患者5例。原发创面清创或病变组织扩大切除后面积为14 cm×10 cm～18 cm×16 cm。术前评估20例患者创面较大，进行常规单叶背阔肌肌皮瓣切取后供区无法直接拉拢缝合，遂切取面积为14 cm×5 cm～18 cm×8 cm双叶背阔肌肌皮瓣进行创面修复，供区直接拉拢缝合；术前评估10例患者进行常规单叶背阔肌肌皮瓣切取后供区可以直接拉拢缝合，切取面积为11 cm×9 cm～13 cm×10 cm单叶背阔肌肌皮瓣修复原发创面后供区张力较大，遗留面积为6 cm×4 cm～8 cm×6 cm继发创面无法直接缝合，采用面积为7 cm×4 cm～9 cm×6 cm供区局部皮瓣修复，第2供区直接拉拢缝合。术中均将背阔肌肌皮瓣中胸背动、静脉与原发受区创面的动、静脉进行端端吻合。观察术后背阔肌肌皮瓣、局部皮瓣成活情况，随访观察供受区外观及功能。结果术后所有患者移植背阔肌肌皮瓣、局部皮瓣均成活。随访6～12个月，背阔肌肌皮瓣色泽接近周围正常皮肤，质地柔软、弹性好。20例采用双叶背阔肌肌皮瓣修复的患者供区遗留线性瘢痕，其中2例患者瘢痕增生，患者均无功能障碍；10例采用单叶背阔肌肌皮瓣及供区局部皮瓣修复的患者供区外形良好，遗留线性瘢痕，形态不规则，无局部牵拉或功能障碍。结论修复较大面积软组织缺损时，术前评估后采用双叶背阔肌肌皮瓣或单叶背阔肌肌皮瓣联合供区局部皮瓣转移，在修复原发创面的同时供区可一次性闭合，术后供区瘢痕小，供受区形态、功能佳。

可持续型皮肤牵张器在头皮及软组织缺损中的应用效果

苑博, 梁海东, 童致虹, 宋文吉, 鞠尚廉

2020, 36(12): 1204-1207. doi: 10.3760/cma.j.cn501120-20200215-00061

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摘要:
目的探讨可持续型皮肤牵张器在头皮及软组织缺损中的应用效果。方法 2017年6月—2020年1月，大连医科大学附属第二医院骨与软组织修复重建外科收治5例大面积头皮及软组织缺损伴颅骨外露患者，其中男3例、女2例，年龄31～57(38.0±2.1)岁，创面面积为16.0 cm×8.0 cm～18.0 cm×12.0 cm。术中行头皮创面清创后，安装可持续型皮肤牵张器，安装后第3天开始对创面进行牵张，每天牵张1 mm，并均分成3次完成，牵张过程中，注意创缘的血运变化及患者的主观感受，当创面牵张至创缘行创面挤捏闭合式试验阴性时，停止进一步牵张，维持最后的牵张状态3 d后，直接拉拢缝合。观察可持续型皮肤牵张器牵张过程中创面愈合情况及并发症发生情况，测量牵张5、10、15、20 d剩余创面面积。随访观察创面愈合情况及毛发生长情况。结果 5例患者创面经牵张治疗19～23 d后直接缝合。牵张过程中创缘无张力性水疱形成，创面缝合后创缘愈合良好，无皮肤坏死发生。牵张治疗5～20 d，创面面积逐渐缩小。术后随访时间2～11(4.5±1.5)个月，牵张处的头皮组织弹性、色泽、感觉与周围正常皮肤组织相似，新生毛发接近正常，创缘可见线性瘢痕，创面无瘢痕形成。结论可持续型皮肤牵张器的应用降低了头皮缺损创面的治疗难度，治疗后新生毛发生长良好，值得临床推广。

单细胞RNA测序在胰岛细胞生物学中的应用研究进展

刘馨竹, 彭毅志, 申传安

2020, 36(12): 1208-1212. doi: 10.3760/cma.j.cn501120-20191127-00445

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摘要:
自2016年首次对人类胰岛进行单细胞水平RNA测序后，涌现了大量关于小鼠及人类胰岛的测序分析结果，为胰岛细胞生物学的研究带来了新的进展。研究证明，单细胞RNA测序技术能够表征罕见类型内分泌细胞，观察到典型内分泌细胞的异质性和新的细胞亚型，更好地分析内分泌细胞的种属间差异，以及更精准地描述胰岛各类型细胞在发育和代谢性疾病中的不同状态。目前，单细胞RNA测序技术对低丰度转录本的检测效能尚较低，但随着技术的改善和分析方法的进步，该技术无疑将成为探索胰岛细胞异质性、发育及代谢性疾病生物学特征的重要工具。

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2020年第37卷第12期

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