Influence of human induced pluripotent stem cell derived skin organoid-conditioned culture medium on the function of human dermal fibroblasts induced by high glucose
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摘要:
目的 探讨人诱导多能干细胞（iPSC）来源的皮肤类器官条件培养基（SO-CM）对高糖诱导的人真皮成纤维细胞（Fb）功能的影响,为糖尿病创面提供治疗思路。 方法 该研究为实验研究。将人iPSC诱导成皮肤类器官 。 将人iPSC来源的皮肤类器官、人真皮Fb分别接种至皮肤类器官培养基（SOM）培养3 d后,收集细胞培养上清液,分别作为SO-CM和Fb条件培养基（Fb-CM）。采用酶联免疫吸附测定法检测SOM、Fb-CM和SO-CM中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素10（IL-10）、IL-18、CC类趋化因子配体2（CCL-2）以及血小板源性生长因子（PDGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子β（TGF-β）、表皮生长因子（EGF）、VEGF-β的含量。将高糖诱导的第8、9代人Fb按照随机数字表法分为SOM组、Fb-CM组、SO-CM组,分别使用均含终物质的量浓度35 mmol/L葡萄糖的SOM、Fb-CM、SO-CM培养。培养24 h后,行免疫荧光染色后计算Ki67阳性细胞比,采用细胞计数试剂盒-8检测细胞吸光度值,代表细胞增殖活力；行细胞划痕试验,计算划痕后13 h的细胞迁移率。培养48 h后,采用荧光探针法检测细胞中活性氧表达,采用β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测细胞β-半乳糖苷酶阳性染色率（代表细胞衰老情况）。样本数均为3。 结果 3种培养基中TNF-α、IL-18、VEGF-β、PDGF、TGF-β含量比较,差异均无统计学意义（P>0.05）。与SOM相比,Fb-CM和SO-CM中IL-10、EGF含量均明显减少（P<0.05）,Fb-CM中CCL-2含量、SO-CM中VEGF含量均明显增加（P<0.05）。培养24 h后,Fb-CM组和SO-CM组的Ki67阳性细胞比[（45.2±6.0）%、（57.4±4.0）%]和吸光度值（124±5、158±12）均明显高于SOM组[（29.6±2.1）%、100±6,P<0.05],SO-CM组的Ki67阳性细胞比和细胞吸光度值均明显高于Fb-CM组（P<0.05）。划痕后13 h,Fb-CM组、SO-CM组细胞迁移率均明显高于SOM组（P<0.05）。培养48 h后,SO-CM组细胞活性氧水平明显高于SOM组、Fb-CM组（P值均<0.05）。培养48 h后,3组细胞β-半乳糖苷酶阳性染色率组间总体比较,差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 SO-CM中VEGF含量高,并能明显促进高糖诱导的人真皮Fb的增殖、迁移和活性氧表达,但对细胞衰老无明显影响。 Abstract:Objective To explore the influence of human induced pluripotent stem cell (iPSC) derived skin organoid-conditioned culture medium (SO-CM) on the function of human dermal fibroblasts (Fbs) induced by high glucose, with the aim of providing treatment ideas for diabetic wounds. Methods This study was an experimental research. Human iPSCs were induced into skin organoids. Human iPSC-derived skin organoids and human dermal Fbs were seeded into skin organoid culture medium (SOM) and cultured for three days, respectively. Then the cell culture supernatants were collected as SO-CM and Fb-conditioned culture medium (Fb-CM), respectively. The content of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-10 (IL-10), IL-18, C-C motif chemokine ligand 2 (CCL-2), platelet-derived growth factor (PDGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), transforming growth factor-β (TGF-β), epidermal growth factor (EGF), and VEGF-β in SOM, Fb-CM, and SO-CM was detected by enzyme-linked immunosorbent assay. Human Fbs of passage 8 and 9 induced by high glucose were divided into SOM group, Fb-CM group, and SO-CM group according to the random number table method, and were cultured with SOM, Fb-CM, and SO-CM all containing glucose at final molarity of 35 mmol/L, respectively. After 24 hours of culture, the Ki67 positive ratio of cells was calculated after immunofluorescence staining, and the cell absorbance value was detected by using cell counting kit-8, representing cell proliferation activity. The cell scratch test was performed to calculate the cell migration rate at 13 hours after scratching. After 48 hours of culture, the expression of reactive oxygen species in cells was detected by fluorescent probe method, and the rate of β-galactosidase-positive staining of cells was detected by β-galactosidase staining kit, representing cellular senescence. The sample size was three. Results There was no statistically significant difference in the content of TNF-α, PDGF, and TGF-β among the three culture media (P>0.05). Compared with that in SOM, the content of IL-10 and EGF in Fb-CM and SO-CM was significantly decreased (P<0.05), while the content of CCL-2 in FB-CM and VEGF in SO-CM was significantly increased (P<0.05). After 24 hours of culture, the Ki67 positive ratio ((45.2±6.0)% and (57.4±4.0)%) and absorbance values (124±5 and 158±12) of cells in the Fb-CM group and the SO-CM group were significantly higher than those in the SOM group ((29.6±2.1)% and 100±6, P<0.05), and the Ki67 positive ratio and absorbance value of cells in the SO-CM group were significantly higher than those in the Fb-CM group (P<0.05). At 13 hours after scratching, the cell migration rates in the Fb-CM group and the SO-CM group were significantly higher than that in the SOM group (P<0.05). After 48 hours of culture, the level of reactive oxygen species in the SO-CM group was significantly higher than that in the SOM group and the Fb-CM group (with both P values <0.05). After 48 hours of culture, there was no statistically significant difference in the rate of β-galactosidase-positive staining of cells among the three groups (P>0.05). Conclusions The SO-CM has high content of VEGF and can significantly promote the proliferation, migration, and expression of reactive oxygen species in human dermal Fbs induced by high glucose, but has no significant effect on cell senescence. -
Key words:
- Culture media, conditioned /
- Fibroblasts /
- Cell proliferation /
- Reactive oxygen species /
- Cell aging /
- Cell migration /
- Skin organoid
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(1)研究得出人诱导多能干细胞（iPSC）来源的皮肤类器官条件培养基（SO-CM）中炎症因子（如白细胞介素10）含量减少和生长因子（血管内皮生长因子）含量增加。
(2)证实了人iPSC来源的SO-CM可促进高糖诱导的人真皮成纤维细胞（Fb）的增殖和迁移。
(3)尽管人iPSC来源的SO-CM提高了高糖诱导的人真皮Fb的活性氧表达,但未明显影响细胞衰老特性。
Highlights:
(1)The study showed that the content of inflammatory cytokines (such as interleukin-10) was decreased and the content of growth factors (such as vascular endothelial growth factor) was increased in human induced pluripotent stem cell (iPSC) derived skin organoid-conditioned culture medium (SO-CM).
(2)It was confirmed that the human iPSC derived SO-CM could promote the proliferation and migration of human dermal fibroblasts (Fbs) induced by high glucose.
(3)Although human iPSC-derived SO-CM increased the expression of reactive oxygen species in human dermal Fbs induced by high glucose, it did not significantly affect the senescence characteristics of cells.
创面愈合是一个动态且复杂的生物过程,涉及炎症、增殖和重塑等生物化学与生理现象[1, 2]。Fb在此过程中发挥重要作用,增殖的Fb能够与新生毛细血管共同组成肉芽组织,以填补组织缺损[3, 4]。然而,高血糖可导致Fb增殖和迁移能力下降,从而阻碍创面愈合过程,这是形成糖尿病足溃疡等糖尿病创面的重要原因之一[5, 6, 7]。单纯控制血糖水平并不能逆转已受损的创面,因此,改善高糖诱导的Fb的功能,是促进糖尿病创面愈合的关键。
诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell,iPSC）是通过向已分化细胞导入重编程因子而形成的多潜能干细胞,iPSC可在特定诱导因子的诱导下分化为各种皮肤细胞,以构建个性化三维皮肤结构[8, 9]。类器官是利用体外三维培养技术建立的在结构和功能上类似于器官的小型组织,具备自我更新、稳定表型、长期培养的能力,同时能够保留遗传特性[10, 11]。人iPSC来源的皮肤类器官的结构与功能接近人体完整皮肤,具有明显的表皮层和真皮层,并含有毛囊、皮脂腺和紧密连接的神经回路[12],为糖尿病创面修复提供了新策略。此外,干细胞分泌物正成为无细胞治疗的潜在来源,其在治疗效果上与细胞疗法相似,且可针对特定应用进行工程化设计；相较于细胞疗法,无细胞疗法被认为更安全,且可作为现成产品[13, 14, 15]。研究显示,iPSC衍生细胞分泌物以及小唾液腺类器官分泌物能有效促进皮肤创面愈合[8,16]。此外,小鼠iPSC诱导的表皮类器官产生的细胞外囊泡高表达VEGF和具有细胞调控功能的微小RNA,可促进细胞增殖和迁移,以及慢性创面愈合[17]。但人iPSC来源的皮肤类器官分泌物对皮肤创面愈合的影响暂未见报道。
条件培养基是经过细胞改造的培养介质,含有细胞分泌物,能够模拟体内环境,提供生理状态的实验条件。本实验研究旨在探讨人iPSC来源的皮肤类器官条件培养基（skin organoid-conditioned culture medium,SO-CM）对高糖诱导的人Fb功能的影响,以期为糖尿病创面提供新的治疗思路。
1. 材料与方法
1.1 细胞及主要试剂与仪器来源
人iPSC和人Fb由中山大学药学院王旭升教授课题组赠予,其中Fb来源于人体腿部皮肤组织。Essential 6培养基、高级DMEM/F12培养基、Neurobasal培养基、GlutaMAXTM添加剂、去除维生素A的B-27添加剂、N-2添加剂、2-巯基乙醇、青霉素-链霉素、U型低吸附96孔板、Multiskan GO型酶标仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司,DMEM培养基购自广州创融生物科技有限公司,TGF-β信号通路抑制剂SB431542购自美国Stemgent公司,重组人碱性FGF蛋白、重组人骨形态发生蛋白4购自美国PeproTech公司,基质胶购自美国康宁公司,诺霉素购自法国InvivoGen公司,骨形态发生蛋白信号通路抑制剂LDN193189购自加拿大Stemcell科技公司,胎牛血清购自上海逍鹏生物科技有限公司。TNF-α、IL-10、IL-18、CC类趋化因子配体2（C-C motif chemokine ligand 2,CCL-2）、VEGF、VEGF-β、血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor,PDGF）、TGF-β、EGF的ELISA检测试剂盒购自武汉菲恩生物科技有限公司。细胞计数试剂盒-8、4',6-二脒基-2-苯基吲哚、兔抗人Ki67单克隆抗体、花青素3标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体、2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯荧光探针、β-半乳糖苷酶染色试剂盒、直径0.45 μm针头滤器购自上海碧云天生物技术股份有限公司。Ti2-U型倒置荧光显微镜购自日本尼康公司,CX34型生物显微镜购自日本奥林巴斯公司。
1.2 人iPSC来源的皮肤类器官的诱导培养
参考文献[12]诱导培养人iPSC来源的皮肤类器官,具体如下。将人iPSC分离成单细胞,并镀在U型低吸附96孔板中,最终形成均匀的iPSC聚集体。将iPSC聚集体转移到新的U型低吸附96孔板上,新板中加入促进分化的Essential 6培养基（含基质胶、SB431542、重组人碱性FGF蛋白、重组人骨形态发生蛋白4）,于37 ℃、含体积分数5%的二氧化碳培养箱中常规诱导培养3 d（常规培养条件下同）。再使用含LDN193189、重组人碱性FGF蛋白和诺霉素的Essential 6培养基常规诱导培养3 d后,加入单纯Essential 6培养基补充营养,继续常规诱导培养6 d。然后将iPSC聚集体移入加入含0.01 g/L基质胶的皮肤类器官培养基（skin organoid culture medium,SOM）的24孔板中,其中SOM为Neurobasal培养基（含去除维生素A的B-27添加剂、N-2添加剂、GlutaMAXTM添加剂、2-巯基乙醇、诺霉素）和高级DMEM/F12培养基的混合物（2种培养基体积比为1∶1）,于细胞培养摇床上常规诱导培养6 d。之后换成不含基质胶的SOM,于细胞培养摇床上继续常规诱导培养62~92 d,最终成功获得人iPSC来源的皮肤类器官,用于后续实验。诱导培养过程中每天观察iPSC聚集体的形态变化。
1.3 Fb条件培养基（fibroblast-conditioned culture medium,Fb-CM）和SO-CM的制备
使用含体积分数10%胎牛血清和100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM培养基（以下简称DMEM完全培养基）培养人Fb至第5、6代。将1×106个第5、6代人Fb接种至SOM中常规培养3 d后,以1 000×g离心5 min收集细胞培养上清液,作为Fb-CM。将人iPSC来源的皮肤类器官接种至SOM中常规培养3 d,同前离心后收集细胞培养上清液,作为SO-CM。立即使用直径0.45 μm针头滤器去除细胞杂质后,将Fb-CM和SO-CM均置于-80 ℃冰箱中备用。
1.4 SOM、Fb-CM和SO-CM中细胞因子含量检测
取SOM、Fb-CM和SO-CM,采用ELISA检测试剂盒检测3种培养基中炎症因子（TNF-α、IL-10、IL-18、CCL-2）以及生长因子（VEGF、VEGF-β、PDGF、TGF-β、EGF）的含量。该实验样本数为3（实验样本数下同）。
1.5 细胞增殖活力检测
1.5.1 免疫荧光染色检测细胞增殖水平
参考文献[18],使用含终物质的量浓度35 mmol/L葡萄糖的DMEM完全培养基培养第5、6代人Fb 10 d以获得高糖诱导的第8、9代人Fb。将高糖诱导的第8、9代人Fb以每孔2 000个的密度接种至加入含终物质的量浓度35 mmol/L葡萄糖的DMEM完全培养基的96孔板中培养24 h后,采用随机数字表法将细胞分为SOM组、Fb-CM组、SO-CM组,分别使用均含终物质的量浓度35 mmol/L葡萄糖的SOM、Fb-CM、SO-CM培养。培养24 h后,行免疫荧光染色,其中加入的一抗为兔抗人Ki67单克隆抗体（稀释比为1∶200）,二抗为花青素3标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体（稀释比为1∶300）；细胞核染色液为4',6-二脒基-2-苯基吲哚,细胞核阳性染色为蓝色。再于倒置荧光显微镜100倍放大倍数下观察Ki67表达情况（阳性染色为红色）,每组取3个视野,计数视野里的所有细胞和阳性细胞,计算Ki67阳性细胞比并取平均值,以此表示细胞增殖活力。
1.5.2 细胞计数试剂盒-8检测细胞增殖水平
取高糖诱导的第8、9代人Fb同1.5.1接种、培养、分组及处理。于培养24 h后,根据细胞计数试剂盒-8说明书,用酶标仪测量各组细胞在波长450 nm处的吸光度值,以此表示细胞增殖活力。
1.6 细胞迁移能力检测
取高糖诱导的第8、9代人Fb以每孔6×104个的密度接种至加入含终物质的量浓度35 mmol/L葡萄糖的DMEM完全培养基的6孔板中,继续培养至细胞生长达90%以上融合时,用规格为1 mL的移液器枪头垂直在各孔单层细胞上划1条直线。吸弃原有培养基后采用PBS冲洗细胞3次,去除划下的细胞。将细胞采用随机数字表法分为SOM组、Fb-CM组、SO-CM组,每孔细胞分别加入均含终物质的量浓度35 mmol/L葡萄糖的SOM、Fb-CM和SO-CM 2 mL。分别于划痕后0（即刻）、13 h,于倒置荧光显微镜100倍放大倍数下拍照并计算划痕后13 h的细胞迁移率。划痕后13 h细胞迁移率=（划痕后0 h划痕面积-划痕后13 h划痕面积）÷划痕后0 h划痕面积×100%。
1.7 细胞中活性氧表达检测
取高糖诱导的第8、9代人Fb同1.5.1接种、培养、分组及处理。培养48 h后,去除培养基,每孔加入50 μL含终物质的量浓度为10 μmol/mL的2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯荧光探针的无血清DMEM培养基,在37 ℃细胞培养箱中孵育20 min后,于倒置荧光显微镜200倍放大倍数下观察活性氧表达（阳性染色为绿色）,用ImageJ软件（美国国立卫生研究院）分析绿色荧光表达情况,以此表示活性氧表达水平。
1.8 细胞衰老情况检测
取高糖诱导的第8、9代人Fb同1.5.1接种、培养、分组及处理。培养48 h后,按照β-半乳糖苷酶染色试剂盒说明书染色后,于倒置荧光显微镜200倍放大倍数观察细胞染色情况,其中衰老细胞的细胞核周围呈蓝绿色,未衰老细胞不着色,计算细胞阳性染色率。
1.9 统计学处理
采用SPSS 27.0和GraphPad Prism 9统计软件进行数据分析。计量资料数据以
2. 结果
2.1 人iPSC来源的皮肤类器官诱导培养过程中iPSC聚集体形态
诱导培养第0天（加入促进分化的Essential 6培养基后即刻）,iPSC聚集体开始分化；诱导培养第3天,iPSC聚集体出现胚层结构；诱导培养第33天,iPSC聚集体可见明显的头尾结构,头部为皮肤细胞,尾部为与皮肤无关的间充质细胞；诱导培养第57天,在囊状皮肤类器官上有毛囊的初级结构；诱导培养第110天,皮肤类器官上有明显的毛囊结构。见图1。
图 1 诱导培养人iPSC来源的皮肤类器官的各时间点的iPSC聚集体形态。1A、1B、1C.分别为诱导培养第0（加入促进分化的Essential 6培养基后即刻）、3、6天,图1A可见iPSC聚集体开始分化,图1B和图1C可见iPSC聚集体出现胚层结构 光学显微镜×100；1D、1E、1F.分别为诱导培养第33、57、110天,图1D可见iPSC聚集体出现明显的头尾结构,图1E可见iPSC聚集体出现毛囊的初级结构,图1F可见皮肤类器官上有明显的毛囊结构 光学显微镜×40注：iPSC为诱导多能干细胞；黄色箭头指示尾结构,红色箭头指示头结构,绿色箭头指示毛囊初级结构,蓝色箭头指示毛囊结构2.2 SOM、Fb-CM和SO-CM中细胞因子含量
3种培养基中TNF-α、IL-18、VEGF-β、PDGF、TGF-β含量比较,差异均无统计学意义（P>0.05）。与SOM相比,Fb-CM和SO-CM中IL-10、EGF含量均明显减少（P<0.05）,Fb-CM中CCL-2含量、SO-CM中VEGF含量均明显增加（P<0.05）。见表1。
Table 1. 3种培养基中细胞因子含量比较（pg/mL,培养基类型 样本数 TNF-α IL-10 IL-18 CCL-2 VEGF VEGF-β PDGF TGF-β EGF SOM 3 0.39±0.68 2.63±0.94 4.5±3.7 1.46±0.26 1.0±0.5 1.41±0.03 2.80±0.28 5.0±0.5 2.26±0.27 Fb-CM 3 0.00±0.00 0.34±0.30 1.9±2.0 206.80±14.80 106.5±36.9 0.07±0.12 6.16±3.64 9.7±6.0 0.74±0.30 SO-CM 3 0.62±1.08 0.31±0.27 10.2±3.4 154.50±24.24 339.2±54.2 0.07±0.06 2.92±1.15 5.6±0.4 0.65±0.27 统计量值 H=0.13 F=15.14 H=4.86 H=7.20 H=7.20 H=5.66 H=4.36 H=5.07 F=31.11 P值 0.999 0.005 0.082 0.004 0.004 0.061 0.132 0.086 <0.001 P1值 0.999 0.008 0.999 0.022 0.539 0.099 0.303 0.076 0.001 P2值 0.999 0.008 0.465 0.539 0.022 0.143 0.999 0.999 0.001 P3值 0.999 0.998 0.090 0.539 0.539 0.999 0.158 0.539 0.921 注：SOM为皮肤类器官培养基,Fb-CM为成纤维细胞条件培养基,SO-CM为皮肤类器官条件培养基,TNF-α为肿瘤坏死因子α,IL为白细胞介素,CCL-2为CC类趋化因子配体2,VEGF为血管内皮生长因子,PDGF为血小板源性生长因子,TGF-β为转化生长因子β,EGF为表皮生长因子；F值、P值为各类型培养基间各指标总体比较所得,P1值、P2值、P3值分别为SOM与Fb-CM、SOM与SO-CM、Fb-CM与SO-CM各指标比较所得 2.3 细胞增殖活力
培养24 h后,Fb-CM组和SO-CM组的Ki67阳性细胞比和细胞吸光度值均明显高于SOM组（P<0.05）,SO-CM组的Ki67阳性细胞比和细胞吸光度值均明显高于Fb-CM组（P<0.05）。见图2和表2。
图 2 3组高糖诱导的人真皮成纤维细胞培养24 h后的Ki67表达情况 花青素3-4',6-二脒基-2-苯基吲哚×100。2A、2B、2C.分别为SOM组细胞核染色、Ki67阳性染色、细胞核与Ki67阳性染色重叠图片；2D、2E、2F.分别为Fb-CM组细胞核染色、Ki67阳性染色、细胞核与Ki67阳性染色重叠图片,图2F中Ki67阳性表达明显高于图2C；2G、2H、2I.分别为SO-CM组细胞核染色、Ki67阳性染色、细胞核与Ki67阳性染色重叠图片,图2I中Ki67阳性表达明显高于图2C注：皮肤类器官培养基（SOM）组、成纤维细胞条件培养基（Fb-CM）组、皮肤类器官条件培养基（SO-CM）组分别使用均含终物质的量浓度35 mmol/L葡萄糖的SOM、Fb-CM、SO-CM培养细胞；细胞核阳性染色为蓝色；Ki67阳性染色为红色,表示细胞增殖活力Table 2. 3组高糖诱导的人真皮成纤维细胞培养24 h后的细胞增殖活力比较（组别 样本数 Ki67阳性细胞比（%） 吸光度值 SOM组 3 29.6±2.1 100±6 Fb-CM组 3 45.2±6.0 124±5 SO-CM组 3 57.4±4.0 158±12 F值 30.99 34.31 P值 <0.001 <0.001 P1值 0.011 0.031 P2值 <0.001 <0.001 P3值 0.032 0.007 注：皮肤类器官培养基（SOM）组、成纤维细胞条件培养基（Fb-CM）组、皮肤类器官条件培养基（SO-CM）组分别使用均含终物质的量浓度35 mmol/L葡萄糖的SOM、Fb-CM、SO-CM培养细胞；F值、P值为组间各指标总体比较所得,P1值、P2值、P3值分别为SOM组与Fb-CM组、SOM组与SO-CM组、Fb-CM组与SO-CM组各指标比较所得 2.4 细胞迁移能力
划痕后13 h,SOM组、Fb-CM组、SO-CM组细胞迁移率分别为（38.1±2.2）%、（47.2±2.8）%、（47.3±2.9）%,组间总体比较,差异有统计学意义（F=11.93,P=0.008）。Fb-CM组、SO-CM组细胞迁移率均明显高于SOM组（P值分别为0.013、0.012）。Fb-CM组与SO-CM组细胞迁移率比较,差异无统计学意义（P=0.998）。见图3。
图 3 3组高糖诱导的人真皮成纤维细胞划痕后各时间点迁移情况 倒置荧光显微镜×100。3A、3B、3C.分别为SOM组、Fb-CM组、SO-SM组划痕后0 h（即刻）的划痕面积,3组划痕面积相近；3D、3E、3F.分别为SOM组、Fb-CM组、SO-SM组划痕后13 h的划痕面积,其中图3D剩余的划痕面积明显大于图3E和图3F注：皮肤类器官培养基（SOM）组、成纤维细胞条件培养基（Fb-CM）组、皮肤类器官条件培养基（SO-CM）组分别使用均含终物质的量浓度35 mmol/L葡萄糖的SOM、Fb-CM、SO-CM培养细胞2.5 细胞中活性氧表达
培养48 h后,SOM组、Fb-CM组、SO-CM组细胞的活性氧表达水平分别为100.0±14.2、92.2±1.4、125.2±6.7,组间总体比较,差异有统计学意义（F=10.82,P=0.010）。SO-CM组细胞活性氧水平明显高于SOM组、Fb-CM组（P值分别为0.033、0.010）；SOM组与Fb-CM组细胞活性氧水平比较,差异无统计学意义（P=0.575）。见图4。
图 4 3组高糖诱导的人真皮成纤维细胞培养48 h后活性氧表达水平 2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯×200。4A、4B、4C.分别为SOM组、Fb-CM组、SO-CM组的活性氧表达,图4C活性氧表达水平明显高于图4A和图4B注：皮肤类器官培养基（SOM）组、成纤维细胞条件培养基（Fb-CM）组、皮肤类器官条件培养基（SO-CM）组分别使用均含终物质的量浓度35 mmol/L葡萄糖的SOM、Fb-CM、SO-CM培养细胞；活性氧阳性染色为绿色2.6 细胞衰老情况
培养48 h后,SOM组、Fb-CM组、SO-CM组细胞β-半乳糖苷酶阳性染色率分别为（22.0±4.7）%、（18.7±4.3）%、（18.2±2.4）%,组间总体比较,差异无统计学意义（F=0.81,P=0.488）。见图5。
图 5 3组高糖诱导的人真皮成纤维细胞培养48 h后β-半乳糖苷酶表达情况 倒置荧光显微镜×200。5A、5B、5C.分别为SOM组、Fb-CM组、SO-CM组β-半乳糖苷酶染色,3组无明显差别注：皮肤类器官培养基（SOM）组、成纤维细胞条件培养基（Fb-CM）组、皮肤类器官条件培养基（SO-CM）组分别使用均含终物质的量浓度35 mmol/L葡萄糖的SOM、Fb-CM、SO-CM培养细胞；衰老细胞的细胞核周围呈蓝绿色,未衰老细胞不着色3. 讨论
Fb通过合成和分泌ECM成分、胶原纤维及多种细胞因子促进创面愈合,在创面愈合的4个阶段（止血期、炎症期、增殖期、重塑期）发挥重要作用[19, 20, 21]。然而,在糖尿病患者中,Fb因长期暴露于高糖环境,ECM合成减少,增殖和迁移能力下降,从而阻碍创面愈合过程[22, 23]。因此,改善高糖诱导的Fb的功能是促进创面愈合的关键。
iPSC与类器官技术的结合为基础研究和临床应用提供了新的策略,尤其在组织再生和创面愈合方面展现出良好前景[24]。最新研究显示,iPSC来源的皮肤类器官结合明胶水凝胶可明显促进冻伤创面修复,通过降低早期炎症、增加表皮干细胞比例以及调控Fb转化,以此重塑ECM,改善愈合效果,减少异常瘢痕形成[25]。这为糖尿病创面及其他难愈创面的治疗开辟了新方向。
本研究探讨了SO-CM对高糖诱导的Fb功能的影响,并分析了SO-CM中细胞因子的变化。通过对皮肤类器官的诱导培养,成功获得了具有皮肤结构和功能特征的iPSC来源的皮肤类器官。在本研究中,ELISA实验结果显示,与SOM相比,SO-CM中VEGF含量明显增加,而IL-10、EGF含量则明显减少。这些细胞因子的变化可能是SO-CM增强高糖诱导的人Fb功能的重要机制之一。VEGF是一种关键的血管生成因子,通过促进新生血管形成、胶原沉积和上皮化促进创面愈合[26, 27, 28]。IL-10是一种关键的抗炎细胞因子,当促进IL-10产生的信号通路受到抑制时,能够调节Toll样受体信号通路的功能,进而促进促炎性细胞因子的产生,增强巨噬细胞和白细胞的反应,最终促进糖尿病创面的愈合[29, 30]。CCL-2是一种强效的巨噬细胞趋化因子,能够明显促进巨噬细胞的浸润；CCL-2在糖尿病创面中下调；局部应用CCL-2可加速糖尿病小鼠皮肤创面愈合,并促进新生血管生成和胶原沉积[31, 32]。本研究中SO-CM中CCL-2含量在数据上明显高于SOM,但二者比较,差异无统计学意义（P>0.05）,可能是样本数过小导致的,后续会进一步增加样本量完善实验。因此,iPSC来源的皮肤类器官细胞分泌的细胞因子可能通过特殊组合增强高糖诱导的人Fb活性。
与SOM相比,SO-CM中生长因子含量明显增加,而抗炎因子含量下调的原因目前还不清楚,可能与类器官中皮肤细胞的特异性表达模式有关。在皮肤类器官的培养过程中,iPSC会分化为表皮细胞、Fb、KC等多种类型细胞。不同类型的细胞在免疫调控中的作用各异,其中KC和Fb通常会高度表达生长因子,促进皮肤上皮与ECM的相互作用及组织修复。而免疫细胞,尤其是巨噬细胞,在类器官中的参与度较低,导致抗炎因子的表达水平下调。
本研究结果显示,SO-CM明显促进了高糖诱导的Fb的增殖与迁移,这表明iPSC来源的皮肤类器官能够在一定程度上克服高糖对Fb功能的抑制作用。此外,本研究结果表明,SO-CM还可明显提高Fb的迁移能力,这一结论与关于iPSC及iPSC衍生的间充质干细胞分泌物的研究结论[33]一致,进一步表明SO-CM具有调节细胞功能的潜力。已有研究表明,iPSC条件培养基可促进Fb迁移,其中的微囊泡可促进烧伤创面KC迁移和创面再上皮化[33, 34, 35]；来源于人iPSC诱导的间充质干细胞的外泌体可以通过促进胶原蛋白合成和血管生成来促进皮肤创面愈合[36, 37, 38, 39]。但iPSC来源的皮肤类器官分泌物在体内如何通过改变创面微环境从而影响创面愈合,尚需进一步探究。
值得注意的是,本研究还显示,尽管在β-半乳糖苷酶染色实验中,3组细胞培养48 h后的衰老特性无明显差异,但SO-CM能够明显提高高糖诱导的人Fb的活性氧水平。这提示iPSC来源的皮肤类器官可能通过调节活性氧水平影响Fb的增殖与迁移,而不是直接诱导细胞衰老的发生。虽然过量的活性氧可能导致细胞损伤和衰老,但适量的活性氧在创面愈合中可发挥重要作用,包括促进血栓形成、增强细菌防御、促进免疫细胞迁移,以及刺激内皮细胞和Fb的增殖与迁移,从而加速新血管和ECM的形成[40, 41]。因此,明确SO-CM如何通过产生适量活性氧促进高糖诱导的人Fb增殖和迁移及其调控的机制,以及如何在创面特定时期使用iPSC来源的皮肤类器官分泌物,以在促进细胞功能的同时,减少细胞损伤是接下来需要解决的问题。
本研究揭示了人iPSC诱导的皮肤类器官分泌物在高糖诱导的对Fb功能的促进作用,提供了促进糖尿病创面愈合的新策略。这一结论丰富了干细胞与再生医学领域的成果,并为糖尿病创面治疗的临床应用奠定了理论基础。未来研究应深入探讨人iPSC诱导的皮肤类器官分泌物在糖尿病创面愈合中的精准作用机制,并探索其临床应用的有效性。
刘志欣、仇恺真：设计并实施研究、采集和分析数据；何佳、王婧薷、刘必来：论文修改、实验指导；信琪、李桂强：实施研究；陈晓东：设计实验、论文撰写、论文评阅、资金支持所有作者声明不存在利益冲突 -
参考文献
(41) [1] WilkinsonHN,HardmanMJ.Wound healing: cellular mechanisms and pathological outcomes[J].Open Biol,2020,10(9):200223.DOI: 10.1098/rsob.200223. [2] HollJ,KowalewskiC,ZimekZ,et al.Chronic diabetic wounds and their treatment with skin substitutes[J].Cells,2021,10(3):655.DOI: 10.3390/cells10030655. [3] desJardins-ParkHE,FosterDS,LongakerMT.Fibroblasts and wound healing: an update[J].Regen Med,2018,13(5):491-495.DOI: 10.2217/rme-2018-0073. [4] TalbottHE,MascharakS,GriffinM,et al.Wound healing, fibroblast heterogeneity, and fibrosis[J].Cell Stem Cell,2022,29(8):1161-1180.DOI: 10.1016/j.stem.2022.07.006. [5] Al-RikabiAHA, TobinDJ, Riches-SumanK,et al.Dermal fibroblasts cultured from donors with type 2 diabetes mellitus retain an epigenetic memory associated with poor wound healing responses[J].Sci Rep,2021,11(1):1474.DOI: 10.1038/s41598-020-80072-z. [6] LiuY,LiuY,HeW,et al.Fibroblasts: immunomodulatory factors in refractory diabetic wound healing[J].Front Immunol,2022,13:918223.DOI: 10.3389/fimmu.2022.918223. [7] RaiV,MoellmerR,AgrawalDK.Role of fibroblast plasticity and heterogeneity in modulating angiogenesis and healing in the diabetic foot ulcer[J].Mol Biol Rep,2023,50(2):1913-1929.DOI: 10.1007/s11033-022-08107-4. [8] DashBC,KorutlaL,VallabhajosyulaP,et al.Unlocking the potential of induced pluripotent stem cells for wound healing: the next frontier of regenerative medicine[J].Adv Wound Care (New Rochelle),2022,11(11):622-638.DOI: 10.1089/wound.2021.0049. [9] ShafieeA,SunJ,AhmedIA,et al.Development of physiologically relevant skin organoids from human induced pluripotent stem cells[J].Small,2024,20(16):e2304879.DOI: 10.1002/smll.202304879. [10] YiSA,ZhangY,RathnamC,et al.Bioengineering approaches for the advanced organoid research[J].Adv Mater,2021,33(45):e2007949.DOI: 10.1002/adma.202007949. [11] HoangP,MaZ.Biomaterial-guided stem cell organoid engineering for modeling development and diseases[J].Acta Biomater,2021,132:23-36.DOI: 10.1016/j.actbio.2021.01.026. [12] LeeJ,RabbaniCC,GaoH,et al.Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells[J].Nature,2020,582(7812):399-404.DOI: 10.1038/s41586-020-2352-3. [13] DaneshmandiL,ShahS,JafariT,et al.Emergence of the stem cell secretome in regenerative engineering[J].Trends Biotechnol,2020,38(12):1373-1384.DOI: 10.1016/j.tibtech.2020.04.013. [14] L PK,KandoiS,MisraR,et al.The mesenchymal stem cell secretome: a new paradigm towards cell-free therapeutic mode in regenerative medicine[J].Cytokine Growth Factor Rev,2019,46:1-9.DOI: 10.1016/j.cytogfr.2019.04.002. [15] BormannD,GugerellA,AnkersmitHJ,et al.Therapeutic application of cell secretomes in cutaneous wound healing[J].J Invest Dermatol,2023,143(6):893-912.DOI: 10.1016/j.jid.2023.02.019. [16] QianJ,LuE,XiangH,et al.GelMA loaded with exosomes from human minor salivary gland organoids enhances wound healing by inducing macrophage polarization[J].J Nanobiotechnology,2024,22(1):550.DOI: 10.1186/s12951-024-02811-y. [17] KwakS,SongCL,LeeJ,et al.Development of pluripotent stem cell-derived epidermal organoids that generate effective extracellular vesicles in skin regeneration[J].Biomaterials,2024,307:122522.DOI: 10.1016/j.biomaterials.2024.122522. [18] 边晓玮,张翠萍,李炳旻,等.胎盘间充质干细胞外泌体对高糖培养的成纤维细胞衰老的影响[J].第三军医大学学报,2020,42(12):1163-1173.DOI: 10.16016/j.1000-5404.202001190. [19] GantwerkerEA,HomDB.Skin: histology and physiology of wound healing[J].Facial Plast Surg Clin North Am,2011,19(3):441-453.DOI: 10.1016/j.fsc.2011.06.009. [20] ParkJW,HwangSR,YoonIS.Advanced growth factor delivery systems in wound management and skin regeneration[J].Molecules,2017,22(8):1259.DOI: 10.3390/molecules22081259. [21] XueM,ZhaoR,MarchL,et al.Dermal fibroblast heterogeneity and its contribution to the skin repair and regeneration[J].Adv Wound Care (New Rochelle),2022,11(2):87-107.DOI: 10.1089/wound.2020.1287. [22] LermanOZ,GalianoRD,ArmourM,et al.Cellular dysfunction in the diabetic fibroblast: impairment in migration, vascular endothelial growth factor production, and response to hypoxia[J].Am J Pathol,2003,162(1):303-312.DOI: 10.1016/S0002-9440(10)63821-7. [23] ZhangP,SongX,DongQ,et al.miR-27-3p inhibition restore fibroblasts viability in diabetic wound by targeting NOVA1[J].Aging (Albany NY),2020,12(13):12841-12849.DOI: 10.18632/aging.103266. [24] WangZ,ZhaoF,LangH,et al.Organoids in skin wound healing[J/OL].Burns Trauma,2025,13:tkae077[2025-02-09].http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/39759541.DOI: 10.1093/burnst/tkae077. [25] WangW,LiuP,ZhuW,et al.Skin organoid transplantation promotes tissue repair with scarless in frostbite[J/OL].Protein Cell,2024:pwae055(2024-10-04)[2024-10-20]. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39363875/.DOI:10.1093/procel/pwae055.[published online ahead of print]. [26] BaoP,KodraA,Tomic-CanicM,et al.The role of vascular endothelial growth factor in wound healing[J].J Surg Res,2009,153(2):347-358.DOI: 10.1016/j.jss.2008.04.023. [27] GoswamiAG,BasuS,HudaF,et al.An appraisal of vascular endothelial growth factor (VEGF): the dynamic molecule of wound healing and its current clinical applications[J].Growth Factors,2022,40(3/4):73-88.DOI: 10.1080/08977194.2022.2074843. [28] ShamsF,MoravvejH,HosseinzadehS,et al.Overexpression of VEGF in dermal fibroblast cells accelerates the angiogenesis and wound healing function: in vitro and in vivo studies[J].Sci Rep,2022,12(1):18529.DOI: 10.1038/s41598-022-23304-8. [29] RoyR,ZayasJ,MohamedMF,et al.IL-10 dysregulation underlies chemokine insufficiency, delayed macrophage response, and impaired healing in diabetic wounds[J].J Invest Dermatol,2022,142(3Pt A):692-704.e14.DOI: 10.1016/j.jid.2021.08.428. [30] SaraivaM,O'GarraA.The regulation of IL-10 production by immune cells[J].Nat Rev Immunol,2010,10(3):170-181.DOI: 10.1038/nri2711. [31] IshidaY,KuninakaY,NosakaM,et al.CCL2-mediated reversal of impaired skin wound healing in diabetic mice by normalization of neovascularization and collagen accumulation[J].J Invest Dermatol,2019,139(12):2517-2527.e5.DOI: 10.1016/j.jid.2019.05.022. [32] WoodS,JayaramanV,HuelsmannEJ,et al.Pro-inflammatory chemokine CCL2 (MCP-1) promotes healing in diabetic wounds by restoring the macrophage response[J].PLoS One,2014,9(3):e91574.DOI: 10.1371/journal.pone.0091574. [33] OhM,KimYJ,SonYJ,et al. Promotive effects of human induced pluripotent stem cell-conditioned medium on the proliferation and migration of dermal fibroblasts[J]. Biotechnol Bioproc E, 2017, 22 (5): 561-568. DOI: 10.1007/s12257-017-0221-1. [34] YanY,WuR,BoY,et al.Induced pluripotent stem cells-derived microvesicles accelerate deep second-degree burn wound healing in mice through miR-16-5p-mediated promotion of keratinocytes migration[J].Theranostics,2020,10(22):9970-9983.DOI: 10.7150/thno.46639. [35] OhM,LeeJ,KimYJ,et al.Exosomes derived from human induced pluripotent stem cells ameliorate the aging of skin fibroblasts[J].Int J Mol Sci,2018,19(6):1715.DOI: 10.3390/ijms19061715. [36] ZhangJ,GuanJ,NiuX,et al.Exosomes released from human induced pluripotent stem cells-derived MSCs facilitate cutaneous wound healing by promoting collagen synthesis and angiogenesis[J].J Transl Med,2015,13:49.DOI: 10.1186/s12967-015-0417-0. [37] ZhouAK,JouE,LuV,et al.Using pre-clinical studies to explore the potential clinical uses of exosomes secreted from induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells[J].Tissue Eng Regen Med,2023,20(6):793-809.DOI: 10.1007/s13770-023-00557-6. [38] KobayashiH,EbisawaK,KambeM,et al.<Editors' Choice> Effects of exosomes derived from the induced pluripotent stem cells on skin wound healing[J].Nagoya J Med Sci,2018,80(2):141-153.DOI: 10.18999/nagjms.80.2.141. [39] KimS,LeeSK,KimH,et al.Exosomes secreted from induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells accelerate skin cell proliferation[J].Int J Mol Sci,2018,19(10):3119.DOI: 10.3390/ijms19103119. [40] DunnillC,PattonT,BrennanJ,et al.Reactive oxygen species (ROS) and wound healing: the functional role of ROS and emerging ROS-modulating technologies for augmentation of the healing process[J].Int Wound J,2017,14(1):89-96.DOI: 10.1111/iwj.12557. [41] HuoYN,ChenW,ZhengXX.ROS, MAPK/ERK and PKC play distinct roles in EGF-stimulated human corneal cell proliferation and migration[J].Cell Mol Biol (Noisy-le-grand),2015,61(7):6-11. -
图 1 诱导培养人iPSC来源的皮肤类器官的各时间点的iPSC聚集体形态。1A、1B、1C.分别为诱导培养第0（加入促进分化的Essential 6培养基后即刻）、3、6天,图1A可见iPSC聚集体开始分化,图1B和图1C可见iPSC聚集体出现胚层结构 光学显微镜×100；1D、1E、1F.分别为诱导培养第33、57、110天,图1D可见iPSC聚集体出现明显的头尾结构,图1E可见iPSC聚集体出现毛囊的初级结构,图1F可见皮肤类器官上有明显的毛囊结构 光学显微镜×40
注：iPSC为诱导多能干细胞；黄色箭头指示尾结构,红色箭头指示头结构,绿色箭头指示毛囊初级结构,蓝色箭头指示毛囊结构
图 2 3组高糖诱导的人真皮成纤维细胞培养24 h后的Ki67表达情况 花青素3-4',6-二脒基-2-苯基吲哚×100。2A、2B、2C.分别为SOM组细胞核染色、Ki67阳性染色、细胞核与Ki67阳性染色重叠图片；2D、2E、2F.分别为Fb-CM组细胞核染色、Ki67阳性染色、细胞核与Ki67阳性染色重叠图片,图2F中Ki67阳性表达明显高于图2C；2G、2H、2I.分别为SO-CM组细胞核染色、Ki67阳性染色、细胞核与Ki67阳性染色重叠图片,图2I中Ki67阳性表达明显高于图2C
注：皮肤类器官培养基（SOM）组、成纤维细胞条件培养基（Fb-CM）组、皮肤类器官条件培养基（SO-CM）组分别使用均含终物质的量浓度35 mmol/L葡萄糖的SOM、Fb-CM、SO-CM培养细胞；细胞核阳性染色为蓝色；Ki67阳性染色为红色,表示细胞增殖活力
图 3 3组高糖诱导的人真皮成纤维细胞划痕后各时间点迁移情况 倒置荧光显微镜×100。3A、3B、3C.分别为SOM组、Fb-CM组、SO-SM组划痕后0 h（即刻）的划痕面积,3组划痕面积相近；3D、3E、3F.分别为SOM组、Fb-CM组、SO-SM组划痕后13 h的划痕面积,其中图3D剩余的划痕面积明显大于图3E和图3F
注：皮肤类器官培养基（SOM）组、成纤维细胞条件培养基（Fb-CM）组、皮肤类器官条件培养基（SO-CM）组分别使用均含终物质的量浓度35 mmol/L葡萄糖的SOM、Fb-CM、SO-CM培养细胞
图 4 3组高糖诱导的人真皮成纤维细胞培养48 h后活性氧表达水平 2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯×200。4A、4B、4C.分别为SOM组、Fb-CM组、SO-CM组的活性氧表达,图4C活性氧表达水平明显高于图4A和图4B
注：皮肤类器官培养基（SOM）组、成纤维细胞条件培养基（Fb-CM）组、皮肤类器官条件培养基（SO-CM）组分别使用均含终物质的量浓度35 mmol/L葡萄糖的SOM、Fb-CM、SO-CM培养细胞；活性氧阳性染色为绿色
图 5 3组高糖诱导的人真皮成纤维细胞培养48 h后β-半乳糖苷酶表达情况 倒置荧光显微镜×200。5A、5B、5C.分别为SOM组、Fb-CM组、SO-CM组β-半乳糖苷酶染色,3组无明显差别
注：皮肤类器官培养基（SOM）组、成纤维细胞条件培养基（Fb-CM）组、皮肤类器官条件培养基（SO-CM）组分别使用均含终物质的量浓度35 mmol/L葡萄糖的SOM、Fb-CM、SO-CM培养细胞；衰老细胞的细胞核周围呈蓝绿色,未衰老细胞不着色
Table 1. 3种培养基中细胞因子含量比较（pg/mL,
培养基类型 样本数 TNF-α IL-10 IL-18 CCL-2 VEGF VEGF-β PDGF TGF-β EGF SOM 3 0.39±0.68 2.63±0.94 4.5±3.7 1.46±0.26 1.0±0.5 1.41±0.03 2.80±0.28 5.0±0.5 2.26±0.27 Fb-CM 3 0.00±0.00 0.34±0.30 1.9±2.0 206.80±14.80 106.5±36.9 0.07±0.12 6.16±3.64 9.7±6.0 0.74±0.30 SO-CM 3 0.62±1.08 0.31±0.27 10.2±3.4 154.50±24.24 339.2±54.2 0.07±0.06 2.92±1.15 5.6±0.4 0.65±0.27 统计量值 H=0.13 F=15.14 H=4.86 H=7.20 H=7.20 H=5.66 H=4.36 H=5.07 F=31.11 P值 0.999 0.005 0.082 0.004 0.004 0.061 0.132 0.086 <0.001 P1值 0.999 0.008 0.999 0.022 0.539 0.099 0.303 0.076 0.001 P2值 0.999 0.008 0.465 0.539 0.022 0.143 0.999 0.999 0.001 P3值 0.999 0.998 0.090 0.539 0.539 0.999 0.158 0.539 0.921 注：SOM为皮肤类器官培养基,Fb-CM为成纤维细胞条件培养基,SO-CM为皮肤类器官条件培养基,TNF-α为肿瘤坏死因子α,IL为白细胞介素,CCL-2为CC类趋化因子配体2,VEGF为血管内皮生长因子,PDGF为血小板源性生长因子,TGF-β为转化生长因子β,EGF为表皮生长因子；F值、P值为各类型培养基间各指标总体比较所得,P1值、P2值、P3值分别为SOM与Fb-CM、SOM与SO-CM、Fb-CM与SO-CM各指标比较所得 
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Table 2. 3组高糖诱导的人真皮成纤维细胞培养24 h后的细胞增殖活力比较（
组别 样本数 Ki67阳性细胞比（%） 吸光度值 SOM组 3 29.6±2.1 100±6 Fb-CM组 3 45.2±6.0 124±5 SO-CM组 3 57.4±4.0 158±12 F值 30.99 34.31 P值 <0.001 <0.001 P1值 0.011 0.031 P2值 <0.001 <0.001 P3值 0.032 0.007 注：皮肤类器官培养基（SOM）组、成纤维细胞条件培养基（Fb-CM）组、皮肤类器官条件培养基（SO-CM）组分别使用均含终物质的量浓度35 mmol/L葡萄糖的SOM、Fb-CM、SO-CM培养细胞；F值、P值为组间各指标总体比较所得,P1值、P2值、P3值分别为SOM组与Fb-CM组、SOM组与SO-CM组、Fb-CM组与SO-CM组各指标比较所得
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