2006, 22(4): 291-295.
摘要:
目的使内毒素结合肽（EBP）及其突变体mEBP在E．coli DH5α中表达，纯化后鉴定其抗内毒素／脂多糖（LPS）活性。方法（1）将含Pinpoint Xa3-EBP及其突变体Pinpoint Xa3-mEBP的工程菌DHSα活化，加入异丙硫半乳糖苷（IPTG）诱导其表达生物素融合蛋白。分离纯化表达产物，因子Xa酶切融合蛋白分离目的肽EBP和mEBP。采用亲和层析及反相高效液相色谱法纯化目的肽，用氨基末端10个氨基酸残基序列分析法鉴定突变体mEBP。（2）分离正常人外周血单核细胞（PBMC），用5mg／L异硫氰酸荧光素（FITC）-LPS＋不同浓度EBP或mEBP（均为2．0、5．0、12、5mg／L）刺激PBMC，检测其平均荧光强度。用1mg／L LPS＋3种浓度（同前）EBP或mEBP刺激PBMC，5h后取上清液，检测肿瘤坏死因子（TNF）α和白细胞介素（IL）6浓度。（3）将25只昆明小鼠分为正常对照组（5只）：腹腔注射等渗盐水0.2ml；模型组（5只）：小鼠造成20％TBSAHI度烧伤，伤后腹腔注射LPS（1mg／kg）；治疗组（15只）：小鼠同前致伤后，腹腔注射多黏菌素B（PMB，5mg／kg）或EBP或mEBP（后两者均为10mg／kg）。6h后检测各组小鼠血清TNF—α、IL-6浓度及肝组织中TNF—α mRNA的表达水平。结果（1）纯化后的目的肽EBP、mEBP纯度均达98％以上，mEBP氨基末端10个氨基酸残基序列分析符合预期结果。（2）随着mEBP或EBP浓度的增加，PBMC表面的平均荧光强度逐渐减弱；且在同一浓度下，加入mEBP后平均荧光强度的减弱程度较加入EBP明显。与用1mg／LLPS刺激PBMC比较，加入1mg／L LPS＋12．5mg／LEBP以及1mg／LLPS＋3种浓度mEBP刺激后，PBMC培养上清液中IL-6及TNF—α的水平均明显降低（P〈0．01）。（3）与模型组比较，治疗组小鼠血清IL-6、TNF-α水平均明显降低（P〈0．01），其中10mg／kg mEBP治疗组两指标低于等浓度EBP治疗组（P〈0．05）。（4）小鼠肝组织TNF—α mRNA表达水平：正常对照组相对灰度值为0．25，模型组为0．93，10mg／kg mEBP治疗组为0．51，10mg／kg EBP治疗组为0．77，5mg／kg PMB治疗组为0．43。结论具有抗LPS活性的小分子肽可通过原核表达获得：EBP及mEBP均具有抗LPS活性，其中mEBP拮抗作用更强。
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